Pasos para el diseño de primers

PASITOS PARA DISEÑO DE PRIMERS

• IR GOOGLE
• ingresar a NCBI 
• Poner GENE → 
• buscar el GEN → TMPRSS6
• TENER EL LOCUS → Cromosoma 22 
• de ahi bajar → podemos trabajar con la 1era o la 2da → REFSEQGENE

[pic 1]

Tomamos como referencia la longitud del exón: 24782 - 24986

• Otra forma es entrar a TOOLS → SEQUENCE VIEW
• Buscamos el 24782 [pic 2]

• ANOTAMOS 4 DATOS cercanos (donde inicia y donde termina / uno de más arriba y de más abajo) al espacio que estamos trabajando, se toma cualquiera el más cercano al exón de estudio (*)

[pic 3][pic 4][pic 5][pic 6]

[pic 7]

>>> MÉTODO FACIL <<<        

• En este caso decidimos trabajar con 21 oligonucleótidos (PRIMER)

[pic 8]

[pic 9]

FOWARD 🡪 GTGCCCCTCTCCCCGCTCCAG (azul)[pic 10]

REVERS 🡪   GTGAGTCCCTGGGAAGGAGGG (rojo)

En el NCBI solo trabajamos con una hebra por ello es que el REVERS esta errado y debemos darle la vuelta, además de que debemos encontrar su complemento. Por ejemplo: Lo de la foto

REVERS (VUELTA) 🡪 GGGAGGAAGGGTCCCTGAGTG

COMPLEMENTO DEL REVERS 🡪 CCCTCCTTCCCAGGGACTCAC

Los datos de amarillo son los que “vamos a utilizar”

• Luego vamos al TM calculator 🡪 https://tmcalculator.neb.com/#!/main
• Seleccionamos Taq DNA Polymerase
• Luego colocamos el Fowar (PRIMER 1) Y Revers (PRIMER 2)
• Vemos las propiedades que nos salen de cada uno de los PRIMERS
• Y vemos el %de GC y Temperatura de fusión (50-60% / 50 – 65 °C)

[pic 11]

>>>> METODO 2 <<<<

• Ir a FASTA
• Tomamos los datos previos elegidos (los más cercanos al exón: subrayados de azul (*) [pic 12]

• Hacemos click en PICK PRIMERS (al lado derecho)
• Si nuestro fragmento es grande es mejor entre 100 – 500 nucleótidos, mejor es menor para que el PCR sea rápido
• Escogemos la cantidad de números de primer (en este caso fueron 10)
• Elegimos la temperatura min (50) y temperatura máx. (65) // Opcional (Temperatura optima 60°C) // La diferencia de temperaturas puede ser 2 o 3 (PREFERIBLE 2)

EL PROFE PUSO 64 COMO TEMPERATURA MAXIMA [pic 13]

• Vamos hasta la parte inferior y llegamos a ADVANCED PARAMETERS (parámetros avanzados)
• ¿Cuál es el tamaño del Primer? 🡪 18 como min y como máximo 24 (Esto es para que tenga una buena temperatura de fusión 🡪 DATO NO CAMBIA por ser estable / VER DIAPOSITIVAS)
• Llenamos el contenido de CG% 🡪 50 – 60 %

[pic 14]

• No modificamos nada mas
• Damos click en SHOW RESULTS IN A NEW WINDOW (parte de abajo)
• Y luego a GET PRIMERS [pic 15]

• “Como supuestamente no nos salió ninguno” USAMOS LOS OTROS DATOS (subrayados de rojo)

[pic 16]

[pic 17]

Luego vamos a: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html

Copiamos el reverse y nos da la inversa y su complemento: CGTGAGTCCCTGGGAAGGAG

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