RTPCR

Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

ABSTRACTO

La técnica de transcripción en reversa la cual es usada por investigadores para generar unas cadenas de DNA específicamente cDNA generadas del RNA. Este tipo de tecnología la que se basa de un mecanismo retroviral el cual una enzima en reversa de transcriptasa logra revertir su transcripción de RNA a DNA.  En la naturaleza la transcriptasa en reversa de una enzima permite los retro virus integrarse y duplicarse al huésped del genoma. El proceso típicamente se lleva a cabo de genoma de RNA a el genoma huésped de DNA dado a sus actividades bioquímicas. Esta actividad compuesta de tres procesos como la actividad RNA dependiente DNA polimerasa, actividad H ribonucleasa y por último la DNA polimerasa. Una vez la enzima domina y se convierte en huésped, la RNA viral y sus enzimas acompañantes las cuales usan nucleótidos huésped para organizar una hebra sencilla complementarias de DNA.  La misma es hibridada de la hebra original de RNA. Conocida como RNAse H encaja el RNA-DNA hibrido así formando una hebra doble dependiente de una polimerasa de DNA. Todo esto se lleva a cabo a una nueva hebra de DNA al ser incorporada en genoma del huésped.

Palabras Claves: cDNA, Transcripción en Reversa, RNA, DNA.

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¿Qué es el RT-PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa es uno de los métodos más utilizados para la detección y cuantificación de mRNA. Es una técnica utilizada por los investigadores para generar una cadena complementaria de ADN (ADNc) a partir de ARN. La tecnología se basa en un mecanismo retroviral mediante el cual la enzima transcriptasa inversa puede transcribir de forma inversa el ARN al ADN. El RT-PCR es una técnica de gran sensibilidad. Este implica un paso de transcripción de una porción del genoma de RNA en cDNA, quien luego es amplificado mediante PCR. [pic 2]

Transcriptasa inversa y cDNA[pic 3]

        La transcriptasa inversa y el cDNA son dos factores importantes durante la técnica de RT-PCR.

        Transcriptasa inversa

La transcriptasa inversa es una enzima codificada a partir del material genético de los ret rovirus, quienes catalizan la transcripción del ARN en el ADN. Esta transcripción se basa en el proceso inverso de la transcripción celular normal de ADN en ARN. La transcriptasa inversa es esencial en la naturaleza infecciosa de los retrovirus, varios de los cuales causan enfermedades en humano como el VIH. Esta enzima también es un componente fundamental en la técnica de laboratorio conocida como reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), método utilizado en la investigación y en el diagnóstico de enfermedades, entre ellas el cáncer.[pic 4]

Un retrovirus consiste en un genoma de ARN contenido dentro de una cubierta de proteínas en una envoltura de lípidos. Este genoma está formado por tres genes: gen de antígeno específico del grupo (gag), gen de la polimerasa (pol) y gen de la envoltura (env).[pic 5]

cDNA

El ADN complementario (cADN) es aquel producido en una plantilla de ARN mediante la acción de la transcriptasa inversa. La secuencia del cADN se convierte complementaria al ARN. La capacidad que posee el ADN de clonarse fácilmente permite que el cADN se doble y se una a vector de ADN, siendo todo esto contrario al ARN. El análisis de secuencia del ADN es mucho más fácil que el del ARN, por lo tanto, el ADNc es la forma esencial en el análisis del ARN, particularmente del ARNm eucariota. 

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