Secuenciacion Adn

Se hizo crecer a pseudomona aeruginosa PAO1162 en medio LB (Luria-Bertani) a constante agitación, hasta obtener una fase logaritmica ( OD= 0.4 – 0.6 a 660nm). Fueron cosechadas por centrifugación (10’; 4°C), lavado dos veces con 5mM de buffer fosfato (pH = 7) conteniendo 300mM de sacarosa y resuspendida en 0.01 del volumen del buffer para brindar células electrocompetentes.

• Se tomó una alicuota de las células electrocompetentes (100 μL), las cuales fueron llevadas a transformación con 10ng de la librería de plásmidos obtenidos a partir de E.coli usando Bio-Rad MicroPulser, incubadas en medio LB por una hora y a agitación a 160 r.p.m. La mezcla fue plaqueada en una membrada de nitrocelulosa, luego ubicada en placas rectangulares de agarosa LB usando camillas de vidrio para esparcir las células uniformemente.

• Las células fueron incubadas toda la noche a 30°C hasta que las colonias en la membrana crecieran 1mm de diametro. Las colonias fueron replicadas en otra membrana de nitrocelulosa. La expresión de las lipasas fue inducida al poner e incubar la membrana replica a 30°C por 24 horas en una placa 1.5% de agarosa conteniendo 10%LB, 100 μg/ml Sm y 1mM de IPTG.

• La preparación de las placas para la tinción y medición de actividad obtuvo una solución buffer y se llevo a autoclave. Luego del enfriamiento se les añadió el sustrato y Fast Garnet GBC para la formación del complejo de color. La solución fue servida en una placa rectangular y llevada a temperatura de ambiente. La membrana de nitrocelulosa con las colonias bacterianas que expresaron las lipasas fueron llevadas a la parte superior del gel para empezar con la actividad de tinción. Los puntos teñidos fueron contrastados mediante softwares para dar una imagen clara de las colonias teñidas.

Mútagenesis aleatoria:

• El gen que codifica la lipasa se mutó al azar por error prone PCR mediante el uso de 0,2-0,3 mM MnCl2. El gen de la lipasa amplificada se ligó corriente arriba de la proteína de replegamiento lip B en el vector de expresión de pLPLsmA y se transfirió a E. coli para construir una biblioteca de lipasas mutadas.

• Se obtuvieron un total de 60000 transformantes de E. coli, la secuenciación del ADN de seleccionados al azar varios transformantes revelaron que las mutaciones se distribuyeron uniformemente sobre el gen de 855 pb de la lipasa con una frecuencia mutacional de tres a cuatro nucleotidos que corresponden a aproximadamente una sustitución de aminoácidos en todo el gen de la lipasa. En estas condiciones mutacionales, 50-70% de los clones totales perdieron la actividad esterasa según lo determinado por la tinción de actividad usando el sustrato éster 1.

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