Describa las técnicas de purificación utilizadas en el artículo escogido por el grupo y explique el fundamento científico de cada una de ellas..

Biotecnología alimentaria

Cuestionario 2. Trabajo colaborativo 2

1. Describa las técnicas de purificación utilizadas en el artículo escogido por el grupo y explique el fundamento científico de cada una de ellas.

R/ Tabla 1. Descripción de las técnicas de purificación de la enzima Inulinasa

[pic 1]

1. Explique la definición de actividad enzimática (U/ml) reportada en el artículo científico.

R/

La actividad enzimática se ensayó midiendo la concentración de azucares reductores libres de inulina, las cuales son: (glucosa, fructosa y sacarosa). La mezcla de reacción (0,5 ml) que contiene inulina 2 mM, acetato de sodio 0,05 M tampón, pH 5,0 y 0,1 unidad de inulinasa se incubó a 40 C durante 1 h, este se estimó por el método de del ácido 3,5-dinitrosalicílico, esta es una técnica de colorimetría para la hidrolisis de polisacáridos presentes en la muestra. Determina las absorbancias por medio de un espectrofotómetro a 560nm. Esta técnica nos lleva a cuantificar los productos de una reacción enzimática. Una unidad de actividad inulinasa (U), se definió como la cantidad de la producción de 1µmol fructosa por hora en condiciones de ensayo estándar enzima.

1. En un laboratorio de investigación se obtiene un extracto enzimático proveniente del sobrenadante de la fermentación de: Bacillus subtilis; se requiere purificar una proteasa (enzima que hidroliza otras proteínas) presente en dicha muestra; se conocen de antemano algunas propiedades de ella como: su peso molecular es de 74 KDa Esta enzima, posee una carga negativa a pH 7,8, su purificación parcial o total es requerida para estudios cinéticos y moleculares.

Describa la metodología de su purificación con la información establecida en la tabla 2.

[pic 2]

Se cuenta con las siguientes técnicas:

a. Sulfato de amonio y una solución al 40% de saturación.

b. Membrana de diálisis de un tamaño de poro de 12000 Da.

c. Dos cartuchos de ultrafiltración con un tamaño de poro de 30 KD y uno de 20 KD.

d. Columna de exclusión por tamaño (sephadex G-100) que separa proteínas entre 50 y 150

KD.

e. Columna de intercambio catiónico (amberlita, la cual retiene cationes (-) a pH 7.8).

1. Si la actividad proteolítica de la enzima del problema anterior (numeral 3) se disminuye a cero, cuál sería la metodología para su purificación.

1. Complete la tabla 3. correspondiente a la purificación enzimática de una levanasa producida por Bacillus subtilis y clonada en E. coli.

R/

Tabla 3. Purification of B. subtilis levanase produced in E. coli.

Tomada de: Erich Wanker, Anton Huber, and Helmut Schwab: Purification and characterization of the Bacillus subtilis Levanase Produced in Escherichia coli. Applied And Environmental Microbiology, May 1995, Vol. 61, No. 5 p. 1953–1958

1. Para poder completar la tabla lo primero que debemos calcular es el porcentaje de rendimiento; que es la relación entre la actividad enzimática total del paso de purificación y el extracto inicial.

• Extracto crudo

[pic 3] 

• Precipitación por sulfato de amonio

[pic 4] 

• Peak I

[pic 5] 

Y así con los demás hasta completar los resultados.

1. Luego hallamos el factor de purificación para el extracto crudo que es:

[pic 6] 

Nota: para hallar este resultado debemos hallar la actividad específica la cual es: [pic 7] y así para los que continúan.

• Precipitación Sulfato de amonio

[pic 8] 

• Peak 1

[pic 9] 

Y así con los demás hasta completar.

1. Describa y explique: electroforesis de proteínas en poliacrilamida, en condiciones nativas y desnaturalizantes y cuál es la importancia en ambas electroforesis del reactivo: beta-mercaptoetanol (βME) y en la detección de subunidades proteicas.  

R/

La electroforesis de proteínas en poliacrilamida (PAGE) es una de las técnicas más usadas para caracterizar mezclas complejas de proteínas.  Es un método rápido y económico a nivel de muestra porque se requieren solo microgramos de proteína. (Antonio, 2008).

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