EXPLORANDO ACTINOMICETOS DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE PLANTAS A PARTIR DE SUELO DE VERMICOMPOSTA Y RIZOSFERA PARA MEJORAR EL RENDIMIENTO EN GARBANZO

EXPLORANDO ACTINOMICETOS DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE PLANTAS A PARTIR DE SUELO DE VERMICOMPOSTA Y RIZOSFERA PARA MEJORAR EL RENDIMIENTO EN GARBANZO

ABSTRACT

El objetivo principal del presente estudio fue aislar y caracterizar actinomicetos para la promoción del crecimiento de la planta en garbanzo. Un total de 89 actinomicetos fueron examinados por su antagonismo contra hongos patógenos de garbanzo por cultivo dual y ensayos de producción de metabolitos. Se evaluaron cuatro actinomicetos más prometedores por sus propiedades fisiológicas y de promoción del crecimiento de plantas en condiciones in vitro e in vivo. Todos los aislamientos exhibieron un buen crecimiento a temperaturas de 20 ◦C a 40 ◦C, rango de pH de 7-11 y concentraciones de NaCl de hasta 8%. Estos también se encontraron altamente tolerantes a Bavistin, ligeramente tolerantes a Thiram y Captan (excepto VAI-7 y VAI-40) pero susceptibles a Benlate y Ridomil en niveles de aplicación de campo y se encontraron que producen sideróforo, celulasa, lipasa, proteasa, quitinasa ( excepto VAI-40), ácido cianhídrico (excepto VAI-7 y VAI-40), ácido indólico y þ-1,3-glucanasa. Cuando los cuatro actinomicetos fueron evaluados por sus propiedades de promoción del crecimiento de las plantas bajo condiciones de campo en garbanzo, todos exhibieron un aumento en el número de nódulos, peso de los brotes y rendimiento. Las parcelas tratadas con actinomicetos mejoraron el N total, el P disponible y el C orgánico sobre el control no inoculado. Los estudios del microscopio electrónico de barrido exhibieron colonización extensa por actinomicetos en la superficie de la raíz del garbanzo. Los perfiles de expresión para los genes de ácido acético indol, sideróforo y þ-1,3-glucanasa exhibieron una regulación positiva para los tres rasgos y en los cuatro aislamientos. Los actinomicetos se identificaron como Streptomyces pero diferentes especies en el análisis de 16S rDNA. Se concluyó que los actinomicetos seleccionados tienen un buen potencial para estimular el crecimiento de las plantas y el control biológico del garbanzo.

INTRODUCTION

El garbanzo (Cicer arietinum L.) es el segundo más ampliamente cultivado cultivo de leguminosa alimentaria después de frijol común, con producción anual de 13.8 millones de toneladas en todo el mundo.1 En todo el mundo, más del 90% de garbanzo la producción ocurre en los trópicos semiáridos de Asia y África. Asia representa el 88% de la producción mundial de garbanzo, mientras que India es el mayor productor que representa el 75% de Asia producción de garbanzo.2 Varios factores bióticos y abióticos fueron involucrado en la baja producción de garbanzo. Los factores bióticos incluyen hongos, bacterias, virus, nematodos, micoplasma y plagas de insectos. Los hongos son el grupo más grande que afecta tallos, raíces, hojas, flores y vainas. La cosecha de garbanzo se ve afectada principalmente por marchitez por Fusarium, pudrición de raíz seca, rotura de collar, plaga de Ascochyta y el moho gris Botrytis causado por Fusarium oxysporum f. sp. ciceri (FOC), Macrophomina phaseolina, Sclerotium rolfsii, Ascochyta rabiei y Botrytis cinerea, respectivamente, lo que resulta en una cosecha reducida rendimiento.3,4

Los microbios en la rizosfera ayudan a las plantas en la promoción del crecimiento y ceder Los actinomicetos son uno de los principales componentes de poblaciones microbianas de la rizosfera y son útiles en el ciclo de nutrientes del suelo5,6, así como en el fomento del crecimiento de las plantas (PGP) .7 Los actinomicetos producen metabolitos secundarios como enzimas líticas, sustancias PGP y antibióticos.8 Los actinomicetos, principalmente aquellos que pertenecen a Streptomyces spp., hacen un importante grupo de microbios del suelo. Streptomyces son abundantes en el suelo y ayuda en la degradación de moléculas complejas a moléculas simples para el crecimiento y desarrollo de las plantas.9,10 También se informa que estos descomponen la materia orgánica, promueven crecimiento de plantas y control de patógenos de plantas. En el presente estudio, actinomicetos aislados de la rizosfera y vermicompost de hierbas se caracterizaron y evaluado para las propiedades de PGP y para los rasgos relacionados con el control biológico. Las cepas prometedoras también se evaluaron para su PGP en garbanzo en condiciones de campo.

Material y métodos

Aislamiento de actinomicetos

Los actinomicetos se aislaron a partir de vermicompost de hierbas (Jatropha curcas, Annona squamosa, Parthenium hysterophorus, Gliricidia sepium y Azadirachta indica) y suelos de rizosfera de garbanzo. Diez gramos de cada suelo de vermicompost y rizosfera se suspendieron en 90 ml de solución salina fisiológica estéril (0,85% de NaCl en agua destilada) en un frasco y se mantuvieron para agitar en un agitador orbital (a 100 rpm) a 28 ± 2 ◦C durante 1 h . Al final de la agitación, las muestras se diluyeron en serie hasta 105 diluciones y las muestras de 104 y 105 diluciones se extendieron (0,1 ml) en agar de aislamiento de actinomicetos (AIA) (HiMedia Laboratories, Mumbai, India) y se incubaron a 28 ± 2 ◦C por 7 días. Colonias prominentes fueron aisladas y almacenadas en agar inclinado AI. Selección de actinomicetos antagonistas contra hongos patógenos de garbanzo Un total de 89 actinomicetos fueron seleccionados por su actividad antagonista contra S. rolfsii, M. phaseolina (tres cepas a saber MP-6, MP-24 y MP-115) y FOC (adquirido a partir de patología de leguminosas, ICRISAT, Patancheru) mediante ensayo de cultivo dual según los protocolos de Gopalakrishnan et al.12 sobre placas de agar de extracto de levadura de casaminoácido de glucosa. Los fragmentos de cultivo de los aislamientos prometedores, basados ​​en el ensayo de doble cultivo, se extrajeron por reparto frente a acetato de etilo (EtOAc) y las fracciones orgánicas (EtOAc) y acuosas resultantes se evaporaron en un evaporador rotatorio y se recogieron en un volumen mínimo de metanol Ambas fracciones se evaluaron por su potencial antagonista frente a los tres hongos patógenos del garbanzo (M. phaseolina, FOC y S. rolfsii). Para esto, se taladró un disco fúngico de 6 mm de diámetro y se mantuvo en el centro de la placa de agar de dextrosa de patata modificada con fracciones orgánicas o acuosas (a una concentración de 0,5%). Las placas de control contenían solo metanol. Las placas se incubaron a 28 ± 2 ◦ C durante 5 días y se registró la inhibición del patógeno para los ensayos de cultivo doble y de metabolito en una escala de 0-4 de la siguiente manera: 0 = sin inhibición; 1 = ligera inhibición; 2 = inhibición moderada; 3 = buena inhibición y 4 = excelente inhibición.

Morfología de la colonia de actinomicetos seleccionados

Los aislados seleccionados de actinomicetos se sembraron en estrías en agar de IA mediante una técnica de rayas en cuadrantes y se incubaron durante 5 días a 28 ± 2 ◦C. Al final de la incubación, las colonias aisladas se observaron por su morfología. La tinción de Gram también se realizó13 y se observó con un microscopio óptico.

Identificación molecular de los actinomicetos seleccionados

Los actinomicetos seleccionados se enviaron a Macrogen Inc., Seúl, Corea para la identificación por análisis de ADNr 16S. Las secuencias obtenidas de Macrogen se compararon con secuencias similares de GenBank, se compararon usando el programa BLAST, 14 se alinearon utilizando el software Clustal W15 y el dendograma se dedujo por el método de unión de vecinos.16 El análisis de Bootstrap se realizó utilizando el programa MEGA versión 4 para estimar la estabilidad estadística de las ramas en conjunto con 1000 repeticiones. Las secuencias (1460 pb para SAI-13, 1474 pb para SAI-291.475 pb para VAI-7 y 1472 pb para VAI-40) se presentaron a NCBI y se obtuvieron los números de acceso.

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