Ensayo Del Lisado De Amebocitos Del Limulus (LAL)

En los últimos años, los principales organismos reguladores de productos farmacéuticos (Farmacopeas) exigen cada vez más en sus monografías la aplicación del método del lisado de amebocitos de Limulus(LAL) para la liberación de pirógenos en productos terminados parenterales. El análisis de pirógenos constituye uno de los principales ensayos en el control de calidad de la fabricación de inyectables por su repercusión en la salud humana, puesto que la presencia y administración de los mismos, es capaz de provocar una serie de respuestas fisiológicas, en su mayoría de carácter perjudicial y en casos extremos, la muerte del paciente. Por las razones anteriores, existe un creciente interés en el conocimiento y dominio de estos métodos. El presente trabajo muestra una revisión bibliográfica del método del LAL, se tratan aspectos como su descubrimiento y estandarización, aparición en la industria farmacéutica y razones para su triunfo, y los basamentos de los principales métodos o variaciones comerciales del LAL (gelificación, turbidimétricos y cromogénicos) que se describen en las Farmacopeas.

Palabras clave: lisado de amebocitos del Limulus:LAL, pirógenos, endotoxinas, lipopolisacáridos: LPS, control de calidad.

Durante la elaboración de productos inyectables hay que tomar todas las medidas concebibles para evitar la contaminación pirogénica, así como disponer de un ensayo confiable de control en el producto terminado. Esencialmente los pirógenos son sustancias que administradas por vía parenteral y en dependencia de la dosis, son capaces de provocar una respuesta febril, shock y muerte. Existe una gran variedad de pirógenos entre los que se encuentran el ácido lipoteicoico, el peptidoglicano, las endotoxinas y ciertos virus, hongos, esteroides y enterotoxinas.1

Por más de 40 años el ensayo de pirógenos mediante la determinación de la respuesta febril en conejos, permaneció prácticamente invariable y su efectividad fue escasamente cuestionada. En la actualidad, para la aprobación y comercialización de gran parte de los productos farmacéuticos y biotecnológicos diseñados para ser administrados por vía parenteral, las principales instituciones reguladoras internacionales exigen el control de pirógenos por el método del lisado de amebocitos de Limulus (LAL). El LAL es un método in vitro que detecta con alta sensibilidad la presencia de endotoxinas bacterianas.

Ante las disposiciones de las Farmacopeas e Instituciones Reguladoras Internacionales, el ensayo del LAL gana cada vez más el interés de la Industria Farmacéutica y Biotecnológica nacional. Teniendo en cuenta además el notable desarrollo que ha alcanzado el método y su importancia para el cumplimiento de las Buenas Prácticas en el proceso de fabricación de inyectables, se presenta la siguiente revisión bibliográfica, que aborda desde la naturaleza y descubrimiento del reactivo LAL y su aparición en la industria farmacéutica, hasta su estandarización y los principales métodos disponibles comercialmente.

EL REACTIVO LAL

La historia del descubrimiento del reactivo LAL comienza en 1956, cuando el doctor Frederick B. Bang reporta la muerte por coagulación intravascular en el cangrejo herradura americano Limulus polyphemus (fig. 1).2 Bang, junto a Jack Levin, revela en 1964 que las endotoxinas son el vector causante de la coagulación de la hemolinfa del Limulus.3 Cuatro años más tarde, estos investigadores comprueban que los elementos responsables de la coagulación inducida por endotoxinas son de naturaleza enzimática, y se encuentran dentro de los amebocitos, único tipo de células presentes en la hemolinfa azul de los cangrejos herraduras.4 Por lo tanto, el reactivo LAL es un extracto acuoso de los amebocitos, compuesto por una cascada de enzimas serino proteasas tipo tripsina capaz de reaccionar frente a pequeñas cantidades de endotoxinas (fig. 2). La bioquímica de la reacción del LAL se conoce en detalle y el mecanismo en cascada parece ser el responsable de su extraordinaria sensibilidad.5,6

FIG. 1. Limulus polyphemus en la costa del Atlántico durante su época de apareamiento en el verano.

FIG.2. Representación de la reacción en cascada entre el LAL (enzimas proteolíticas tipo tripsina) frente a las endotoxinas y las ß-(1-3) glucanas según el modelo actual.5,6

Además del Limulus el cual habita en algunos puntos de la costa del Atlántico de los Estados Unidos hasta el Golfo de México, existen otras 3 especies de cangrejos herraduras oriundos del continente asiático: el Tachypleus tridentatus, el Carcinoscorpius rotundicauda y el Tachypleus gigas. Estos animales son artrópodos marinos muy conocidos por su récord fósil debido a que evolucionaron muy poco en los últimos 300 millones de años.7,8

DETECCIÓN DE ENDOTOXINAS MEDIANTE EL ENSAYO DEL LAL

En tanto que el ensayo de pirógenos en conejos es capaz de detectar cualquier sustancia pirogénica, el ensayo del LAL solo detecta endotoxinas. Las endotoxinas son compuestos químicos complejos que se encuentran exclusivamente en la membrana externa de la pared celular de las bacterias gramnegativas.1,9

Este aspecto a primera vista es, sin lugar a dudas, una desventaja para la implementación del ensayo en la liberación de producto terminado. Sin embargo, los primeros defensores de la aplicación del LAL en la industria farmacéutica plantearon que esta característica no era un inconveniente determinante, debido a que las endotoxinas eran el pirógeno más relevante por las razones que se detallan a continuación. En primer lugar, como las bacterias gramnegativas son tan ubicuas, capaces incluso de colonizar el agua destilada, puede esperarse que ellas y/o sus endotoxinas estén presentes en cierto nivel en la mayoría de los artículos, contaminando comúnmente las materias primas y el equipamiento empleado para la producción de inyectables.10,11 Ellas son el pirógeno que más se ha encontrado entre los lotes contaminados10,12 y debido a su alta resistencia a la destrucción térmica y química, sobrevive a los métodos ordinarios de esterilización.13 Por último, las endotoxinas se caracterizan sobre todo por su potente actividad biológica, por lo que son capaces de producir profundos cambios fisiológicos cuando son administradas por vía parenteral.1,14 Una dosis de 1-10 ng/kg de endotoxina puede provocar una respuesta febril en el hombre.15

APARICIÓN DEL LAL EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA

La primera pregunta sería: ¿por qué sustituir un método que hasta el momento había resultado adecuado por otro? Las primeras respuestas de las ventajas del LAL para la industria farmacéutica aparecen con los trabajos de James F. Cooper y otros a principios de la década de los 70.16-19

Cooper aplica por primera vez el LAL

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