Determinación de la actividad enzimática de un coctel celulolítico comercial

Práctica No. 1. Determinación de la actividad enzimática de un coctel celulolítico comercial

INTRODUCCIÓN

El agotamiento del petróleo destinado a la producción de combustibles fósiles y la necesidad de reducir las emisiones de gases de efecto invernadero para mitigar el calentamiento global, ha generado un creciente interés mundial en desarrollar fuentes de energía alternativas. La preparación de biocombustibles a partir de biomasas de origen renovable es una de ellas. En particular, la producción de bioetanol a partir de biomasas lignocelulósicas ha surgido como una posibilidad. Esta última está compuesta principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina. Varios países alrededor del mundo están interesados en explotar el potencial de los residuos agrícolas debido a su bajo costo y amplia disponibilidad. Combinando un proceso de pretratamiento eficiente, seguido de una hidrólisis enzimática para generar azúcares fermentables y finalmente la producción de etanol, sigue siendo un gran reto.

Se ha demostrado que las enzimas celulasas también se unen permanentemente a la lignina, formado complejos enzima-lignina improductivos, lo cual reduce la cantidad de enzima disponible para actuar sobre la holocelulosa (matriz de hemicelulosa-celulosa).

Por lo menos hay tres grandes grupos de enzimas celulasas involucradas en el proceso de hidrólisis de la celulosa, que es el componente mayoritario en la biomasa lignocelulósica: (1) endoglucanasas (EG, endo 1,4-D-glucohidrolasa o EC 3.2.1.4), (2) exoglucanasas o celobiohidrolasas (CBH, celobiohidrolasa 1,4-β-D-glucano, o EC 3.2.1.9.1) y (3) β-glucosidasa (EC 3.2.1.2.1). Las primeras atacan regiones de baja cristalinidad de la celulosa para crear terminales libres. Posteriormente, las segundas degradan la biomolécula por eliminación de unidades de celobiosa provenientes de las cadenas terminales libres. Finalmente, las terceras hidrolizan a la celobiosa para producir glucosa.

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Para un área temática complicada que involucra procedimientos de ensayo para cuantificar la actividad de varias enzimas asociadas con el sistema: celulosa-celulasa, diversos grupos de investigación y especialistas se involucraron hace varias décadas y pudieron acordar un borrador definitivo (Ghose, 1987).

OBJETIVOS

Determinar la actividad celulolítica, en unidades de FPU/mL, de un coctel enzimático celulolítico comercial disponible en el mercado.

MATERIAL POR EQUIPO

Material de laboratorio

• Tubos de ensayo de 10 mL con taparrosca
• Celdas de plástico para espectrofotómetro de UV-VIS
• Vasos de precipitados de 50, 100 y 500 mL
• Tubos Eppendorf de 2 mL.
• Papel Whatman No.1

Equipo de laboratorio

• Espectrofotómetro de UV-VIS.
• Incubadora con agitación orbital
• Parrillas de calentamiento con agitación magnética.
• Matraces Erlenmeyer de 125 mL.
• Pipetas automáticas de 1 mL y 0.1 mL

Reactivos y disoluciones

• 500 mL de reactivo DNS (ácido dinitrosalicílico, tartrato de sodio y potasio).
• 1 frasco ámbar de vidrio de 500 mL.
• Glucosa

Ensayo de sacarificación de papel filtro con celulasas (Ensayo FPU). Sustrato: tira de papel de filtro Whatman No.1: 1.0 x 6.0 cm (~50 mg).

Método

1. Agregue 1.0 mL de citrato de sodio 0.05 M, pH 4.8, a un tubo de ensayo con taparrosca y volumen de al menos 25 mL.

2. Añadir 0.5 mL de enzima, diluida en tampón citrato. Se deben hacer al menos doce diluciones de la enzima investigada. La dilución objetivo debe liberar un poco más y un poco menos de 2.0 mg de glucosa en las condiciones de reacción.

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