ADN RECOMBINANTE

CAPITULO 19 TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE.

DNA recombinante: hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Se reserva generalmente para las moléculas de DNA producidas por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas.

Enzimas de restricción: para generar fragmentos específicos de DNA se utilizan estas proteínas.

La tecnología del DNA recombinante y la clonación de genes proporciona a los científicos métodos para aislar grandes cantidades de genes específicos o de otras secuencias de DNA a partir de genomas grandes y complejos.

Todas las enzimas de restricción se unen al DNA y reconocen una secuencia específica de nucleótidos, denominada secuencia de reconocimiento.

Las enzimas de restricción tienen la capacidad de cortar el DNA genómico de manera precisa y reproducible en fragmentos denominados fragmentos de restricción.

Palíndromo: simetría en el que la secuencia nucleotídica se lee igual en ambas cadenas del DNA en dirección 5’-3’.

DNA ligasa: enzima que puede unir covalentemente los fragmentos para formar una molécula de DNA recombinante.

Vectores: son moléculas transportadoras de DNA que transfieren y replican (clonan) fragmentos de DNA insertados. Cuando se une un fragmento de restricción al vector, pude entrar a la célula huésped, donde se puede replicar o clonar en muchas copias.

Para que sirva de vector, una molécula de DNA debe ser capaz de replicarse independientemente junto con el fragmento de DNA que transporta.

Vectores recombinantes: vectores que transportan un fragmento insertado.

Vectores plasmídicos: primeros vectores que se desarrollaron, proceden de moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural, que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas. Permiten la producción de muchas copias del DNA clonado. Ejemplo pUC18.

Bacteriófago lambda (λ): vector utilizado para transportar trozos de DNA insertado más largos. Para funcionar como vector, el tercio central de su cromosoma puede ser remplazado por el DNA foráneo.

Vectores cósmidos: son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos.

Cromosoma artificial bacteriano: vector con gran capacidad de clonación que pueden transportar fragmentos de DNA muy largos, basado en el plásmido de fertilidad de bacterias.

Vectores de expresión: están diseñados para producir muchas copias de una proteína seleccionada en una célula huésped, se puede utilizar tanto para eucariotas como procariotas. Ejemplo pET.

La replicación se produce tras la transferencia de las moléculas recombinantes en las células huésped. Este método es conocido como clonación basada en células.

Las células de levadura se usan como huéspedes eucarióticos para la clonación. Cromosoma artificial de levadura (YAC) es el vector de clonación para levaduras.

Se pueden utilizar distintos tipos de vectores para transferir DNA a células eucarióticas. Cuando el vector es un plásmido, la transferencia de DNA se denomina transformación. Cuando el vector es un virus, la incorporación se denomina transfección.

La transferencia de genes a plantas superiores, utiliza vectores plasmídicos bacterianos. Las plantas o animales que contienen un gen exógeno se denominan transgénicas.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): método rápido de clonar DNA y elimina la necesidad de células huésped para clonar DNA. Copia secuencias específicas de DNA mediante una serie de reacciones in vitro.

La acción de PCR está dada por tres pasos: desnaturalización del DNA de doble cadena, hibridación de los cebadores y extensión por la polimerasa. La PCR es rápida y puede realizarse en unas pocas horas en cambio de dias como la clonación basada en células.

El resultado de una clonación son segmentos de DNA relativamente pequeños, que pueden representar un único gen o incluso solo una porción de un gen. El conjunto de clones de DNA procedentes de un solo individuo se denomina biblioteca de clones. Pueden representar un genoma completo, un cromosoma o un conjunto de genes activos.

Una biblioteca genómica (genoteca) contiene al menos una copia de todas las secuencias del genoma de un organismo. Se construyen utilizando métodos de clonación con células huésped.

Bibliotecas específicas de cromosomas: construidas a partir de una fracción subgenomica, un cromosoma, valiosa para seleccionar genes específicos y examinar la organización del cromosoma.

Bibliotecas de cDNA: contienen copias de DNA hechas a partir de las moléculas de mRNA presentes en una población celular en un momento dado y representan genes activos en la célula. Se denomina cDNA porque el DNA es complementario a la secuencia de mRNA.

Para rastrear una biblioteca y recuperar clones de un gen específico se usan sondas. Una sonda es una secuencia de DNA o RNA marcada y complementaria a una parte de la secuencia clonada presente en la biblioteca.

CAPITULO 20 GENÓMICA Y PROTEÓMICA.

Genoma: se acuño en 1920 para referirse al conjunto de genes que llevan los organismos.

Genómica: el estudio de genomas, utilizando un método de secuenciación de DNA. La genómica incluye diversos campos:

genómica estructural: construcción de los datos de la secuencia del genoma, descubrimiento y localización de genes y construcción de mapas génicos.

Genómica funcional: estudia la función biológica de los genes, su regulación y sus productos.

Genómica comparativa: compara la secuencia de genes y proteínas de diferentes genomas. Se usa para desarrollar organismo modelo para las enfermedades humanas.

Proteómica: extensión de la genómica, estudia las proteínas presentes en una célula en un momento dado bajo condiciones determinadas. La proteómica incluye:

1) identificación de proteínas expresadas en una célula, 2) alcance de cualquier modificación postraduccional de proteínas, 3) alcance de interacciones entre proteínas, y 4) localización subcelular de proteínas.

Proyecto genoma Humano (HGP) determina la secuencia de los millones de pares de bases del genoma humano haploide e identifica los genes que contiene.

La genómica dice que la secuenciación es la base para identificar y cartografiar todos los genes del genoma. Métodos para secuenciar genomas:

Método de clon a clon: empieza con la construcción de una biblioteca, los clones se ensamblan en mapas genéticos, la secuencia nucleotídica se determina clon a clon.

Método de la perdigonada: se hacen dos o tres preparaciones de DNA genómico. Una

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