ADN Recombinante

ADN recombinante.

Esta técnica reposa sobre la observación de la recombinación del ADN in – vivo durante la conjugación y la transformación en el mundo de las bacterias.

Está regida por tres premisas fundamentales:

• Lectura precisa de la secuencia de nucleótidos del ADN.

• Recorte de ADN con las enzimas de restricción y el ligamento de los restantes fragmentos de ADN con otras enzimas.

• Localización de vectores de clonación, es decir, fragmentos de ADN que deben de tener las sig. propiedades:

 Deben ser capaces de replicarse, es decir, poseen un origen de replicación compatible con la especificidad de la célula donde ha sido introducido.

 Debe poseer un gen que le confiera una propiedad particular a la célula en el que se encuentra, para poder separar las células que contienen el vector de aquellas que no lo contienen.

Las secuencias de ADN recombinadas pueden ser obtenidas por diferentes medios:

• Por síntesis química.

• Por copia del ARN mensajero, una enzima llamada transcriptasa inversa, aislada de ciertos virus (los retrovirus, en los que el genoma está constituido por ARN) es capas de copiar bajo la forma de ADN tanto una secuencia de ADN como de ARN. Puede, a partir de una secuencia de ARN mensajero, formar una cadena de ADN complementaria. La manera más corriente de clonar este ADN complementario es hacerlo copiar por un ADN polimerasa ó transcriptasa para así obtener un ADN de doble cadena. Se deberán formar cortes colgantes para facilitar su inserción posterior opr alguno de los tres procedimientos siguientes:

• Partiendo el ADN por una enzima de restricción.

• Adicionando colas de una serie de desoxinucleótidos idénticos formando una sola cadena a cada lado del ADN.

• Adicionando sitios de restricción obtenidos por síntesis orgánica.

La utilización de secuencias de ADN recombinante ofrece una ventaja ligada a la estructura compleja de los genes de los organismos superiores. En efecto, las secuencias correspondientes a los intriones que interrumpen las regiones codificantes de los genes eucariotas no pueden ser reconocidas y recogidas por los ARN precursores de las bacterias, y evita la síntesis de proteínas aberrantes.

Los ARN mensajeros citoplasmáticos de las eucariotas han sufrido ya el empalme y su copia en ADN complementario podrá ser utilizada como gen para las bacterias.

Por aislamiento de un gen de un cromosoma, de células de organismos superiores. Para realizarlo, se procede en dos etapas:

 Se construye una “biblioteca” del genoma, se recorta el cromosoma con la ayuda de una enzima de restricción y se inserta la mezcla de millones de fragmentos de ADN obtenidos en un número equivalente de vectores.

 Luego de haberse multiplicado esta población de vectores recombinados, se seleccionará el ó los fagos que contienen el gen buscado. A este fin, se cierne la biblioteca a través de un medio de sondeo molecular del ADN específico del gen, el ADN complementario de su ARN mensajero o radiactivos se apareará e hibridará con la secuencia complementaria presente en el ADN del fago que contiene al gen. No quedará más que aislar al fago reparado, amplificarlo y preparar el ADN para estudiar al gen clonado.

La recombinación genética consiste en cortar las cadenas de ADN y a un plásmido, con la misma enzima de restricción, e insertar el fragmento del ADN en el plásmido, terminando con la acción del ligamento.

La técnica que utiliza un bacteriófago es similar, como el genoma del fago tiene un largo máximo y contiene genes inútiles es frecuente también remplazar fragmentos de ADN en lugar de insertar un nuevo fragmento, el que puede estar disponible al cortar al plásmido con la misma endonucleasa que se utiliza luego de la recombinación.

La elección del método y del gen a clonar dependerá evidentemente del fin perseguido y de la utilización posterior del organismo modificado, y a las posibilidades de expresión del organismo transformado.

Los vectores utilizados son generalmente plásmidos, que preferiblemente deben de ser de talla pequeña y presentar sitios únicos de restricción fácilmente identificables para la inserción de los genes. Son aislados por la gelectroforesis o por ultracentrifugación y eventualmente modificados de acuerdo a las necesidades. Finalmente, la célula huésped ideal debe de ser fácil de transformar y de cultivar, producirse con rapidez, y estar genéticamente bien caracterizada.

El microorganismo más utilizado como receptor es la bacteria Escherchia coli, y también la Bacilus subtilis.

ARN contrasentido

Las

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