AISLAMIENTO DE LÍNEAS CELULARES: DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD Y AJUSTE DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

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Univ.:            ROALNDO A Q[pic 2]

PRÁCTICA 6

AISLAMIENTO DE LÍNEAS CELULARES: DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD Y AJUSTE DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

1. OBJETIVOS

        A. OBJETIVO GENERAL

Determinar el porcentaje de viabilidad celular y realizar ajuste de concentración celular.

        B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Realizar el aislamiento de células polimorfonucleares por el Método Ficoll-Hypaque.
• Relacionar la viabilidad celular con la concentración celular.

2. RESULTADOS

        A. VIABILIDAD CELULAR

a. Método Ficoll-Hypaque[pic 3][pic 4][pic 5]

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• Cálculo del porcentaje de viabilidad celular

Datos:

# Células totales= 18

# Células viables= 18

# Células muertas= 0

% viabilidad celular= ?

                        b. Método perlas inmunomagnéticas[pic 24][pic 25][pic 26]

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• Cálculo del porcentaje de viabilidad celular

Datos:

# Células totales= 13

# Células viables= 13

# Células muertas= 0

% viabilidad celular= ?

        B. AJUSTE DE CONCENTRACIÓN CELULAR

a. Método Ficoll-Hypaque

Después del tratamiento con Ficoll-Urografina, se recupera de la interface, 3mL de polimorfonucleares, mismos que son  resuspendidos en 8mL de Solución fisiológica, posteriormente en 10mL se SF y finalmente en 500µL (0,5mL) de SF:

• Factor de dilución:
• # células vivas/mL (Ci) = #células contada vivas x 105

    =  18 x 106 = 1,8 x 106 cel/mL

*

• Ajuste de concentración celular[pic 45]

Datos: 

Ci= 1,8 x 106 cel/mL

Vi= 500µL

Cf= 2,5 x 106 cel/mL

Vf= ?

                b. Método perlas inmunomagnéticas

• Factor de dilución:

• # células vivas/mL (Ci) = #células contada vivas x 105

    =  13 x 1 x 104 = 1,3 x 106 cel/mL

• Ajuste de concentración celular[pic 46]

Datos: 

Ci= 1,3 x 106 cel/mL

Vi= 500µL

Cf= 2,5 x 106 cel/mL

Vf= ?

3. DISCUSIÓN

• Aislamiento de células.- Las soluciones de Ficoll-Hypaque consisten en un medio de polisucrosa y radiopaco, la cual está ajustada a una densidad de 1,077 (en nuestro caso trabajamos con una densidad de 1,080). Al centrifugar cada componente subcelular se desplazará en el tubo de centrifugación de acuerdo a su densidad hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. Como consecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas al fondo del tubo contendrán las partículas con mayor densidad de flotación. Este método también se conoce como equilibrio en gradiente de densidad. Las células Mononucleares permanecen entre el plasma y la solución HISTOPAQUE, mientras que los eritrocitos y los granulocitos gravitan hacia el fondo, se realiza centrifugación para que las diferentes capas de densidad estén bien definidas y así extraer el anillo o capa correspondiente a las células polimorfonucleares.

En el caso de uso de microperlas inmunomagneticas, consiste en el empleo de anticuerpos monoclonales (AcMcs), unidos a perlas magnéticas; en esta, los anticuerpos específicos se conjugan con partículas magnéticas y se unirán a células que expresen el antígeno diana, la aplicación de un campo magnético atraerá las células hacia un imán, separándolas del resto de las poblaciones celulares.

Como se ha reportado en la literatura, la separación en gradientes de densidad se basa en que los linfocitos son menos densos que los eritrocitos y los granulocitos. La densidad del Ficoll es mayor que la de los linfocitos, pero menor que la de los eritrocitos y los granulocitos. Durante la centrifugación, los eritrocitos y los polimorfos nucleares atraviesan el Ficoll se depositan en el fondo del tubo, mientras que los linfocitos quedan retenidos en la interface entre el plasma y el Ficoll, gracias a su densidad especifica. Este hecho pudo ser observado visualmente, observando la formación clara de tres fases.

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