FRACCIONAMIENTO CELULAR. DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTÉICO

INTRODUCCIÓN

Por definición, y a diferencia de las células procariontes, las células eucariontes poseen un núcleo que contiene la mayoría del DNA envuelto en una membrana. Esto deja al material genético en un compartimento separado del resto de los contenidos de la célula o citoplasma, donde ocurren las reacciones metabólicas. En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales cumplen funciones específicas dentro de la célula.

Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las técnicas adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y macromoléculas que la componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal propósito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Alberte Claude y Christian Duve entre1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la célula en base a su tamaño y densidad.

Finalmente, cabe resaltar que una separación pura de una proteína es esencial para poder determinar sus propiedades y su actividad. Puesto que las células las contienen miles de tipos de diferentes proteínas.

I. OBJETIVOS

Adquirir destrezas en el manejo y en la obtención de órganos y fracciones celulares a partir de un ratón de laboratorio.

Obtener homogenizados de hígado de rata.

Separar fracciones subcelulares del homogenizado de hígado de rata mediante el proceso de centrifugación diferencial.

Determinar el contenido de proteínas en las diferentes fracciones obtenidas.

Aplicar el método de Biuret en la cuantificación de proteínas totales.

II. MARCO TEÓRICO

El fraccionamiento celular permite separar los componentes de las células. Las membranas y organelos celulares suelen separarse mediante centrifugadoras, aparatos que hacen girar tubos de ensayo. Esto ejerce una fuerza centrífuga en el contenido de los tubos, que sedimenta las partículas suspendidas en la solución (como los organelos y membranas de células).

Algunas de estas partículas, como las mitocondrias, son organelos completos. Otras son pequeñas vesículas cerradas, llamadas microsomas, constituidas por membranas de Retículo Endoplasmático, complejo de Golgi y membrana plasmática. Después de la centrifugación algunas de las partículas forman un condensado en el fondo del tubo. Las diferentes partes celulares tienen densidad distinta, lo que permite separarla en fracciones celulares al centrifugar la suspensión a velocidad creciente (centrifugación diferencial).

Las membranas y los organelos de los condensados resuspendidos pueden purificarse después mediante centrifugación por gradiente de densidad, que se ilustra como el último paso en la figura. El condensado resuspendido se dispone en una capa en la parte superior de un gradiente de densidad, por lo general compuesto de una solución de sacarosa y agua. Dado que las densidades de los organelos y las membranas difieren, cada uno emigrará durante la centrifugación y formará una banda a una altura distinta en el gradiente. (1)

Centrifugación Diferencial o Pelleting

En este método, el tubo de la centrífuga es llenado inicialmente con una mezcla uniforme de la solución de la muestra, a través de la centrifugación se obtiene una separación de dos fracciones: Un pellet (sedimento) que contiene la partícula sedimentada y un sobrenadante con la fracción no sedimentada de la solución. Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el pellet, o podría estar distribuido en ambas fracciones, dependiendo

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