Fraccionamiento Celular

El fraccionamiento celular es una técnica de laboratorio, tras la disgregación, en la que se intenta reagrupar las partículas, generalmente células u orgánulos celulares, en función de sus propiedades biofísicas es usado para investigar la bioquímica y fisiología de orgánulos fuera del ambiente complejo de la célula intacta.

Mediante el fraccionamiento celular se consigue separar conjuntos homogéneos, por lo general de orgánulos, a partir de una población heterogénea de células.

El objetivo principal de ésta práctica es aislar los cloroplastos, núcleo y mitocondria del tejido de plantas por el método de fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscópicamente y estimar el coeficiente de sedimentación de los cloroplastos.

Existen tres etapas principales en el fraccionamiento celular:

1. Disgregación o rotura (homogeneización) de las células y liberación de los orgánulos.

2. Macro filtración.

3. Purificación de componentes celulares o fraccionamiento celular propiamente dicho: Se aplican técnicas de centrifugación diferencial y en gradiente.

HOMOGENIZACIÓN: Pará preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado (una solución amortiguadora, salina ó azúcar isotónica).

CENTRIFUGACIÓN: Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una fuerza centrífuga.

CENTRIFUGACION DIFERENCIAL: En la centrifugación diferencial, el homogéneo es centrifugado repetidas veces a altas velocidades, sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas.

La técnica se inicia con la homogeneización. El tejido se tritura en un homogeneizador de manera que las células se comprimen y se libera su contenido. Lo que luego se hace con ese extracto es someterlo a diferentes centrifugaciones a diferentes velocidades y tiempos, de manera que obtenemos fracciones enriquecidas de los distintos orgánulos.

Las células se homogeneizan siempre en una solución tamponada la cual ayuda a estabilizar el pH y, por lo tanto, evita daños en el contenido de las células durante la extracción. Ocasionalmente, el homogeneizado resultante se debe filtrar para eliminar el tejido conjuntivo o de otros elementos indeseables. Dependiendo de la naturaleza del contaminante, esto puede ser tan simple como verter el homogeneizado a través de gasa y recoger el filtrado en el otro lado. En todos los tiempos después de la homogeneización, el homogeneizado se debe mantener frío para minimizar la actividad de las proteasas, enzimas que desmenuzan proteínas. A veces también se añaden inhibidores de proteasa.

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