FRACCIONAMIENTO CELULAR . PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

FRACCIONAMIENTO CELULAR

PRESENTACIÓN:

Presentamos este tema con el propósito de aprender, informarnos y aclarar todas las dudas acerca del tema e informamos todo lo aprendido en la práctica de laboratorio sobre obtención y análisis de fracciones celulares.

INTRODUCCIÓN:

Existen diferentes técnicas para el estudio de la composición celular entre ellas las fisiológicas, bioquímicas y citológicas, esto permite analizar la anatomía y localización de las estructuras celulares. Uno de los procedimientos mas utilizados es el de fraccionamiento celular, el objetivo de este es obtener fracciones puras de un componente celular, el procedimiento tiene 3 etapas indispensables para que el procedimiento sea exitoso el primer paso es el Homogenizado, el segundo paso es el Filtrado y por último el Centrifugado.

En la practica de laboratorio llevamos acabo el proceso de fraccionamiento celular utilizando un hígado de pollo, en este tuvimos que llevar acabo los tres procedimientos, utilizando otros componentes como el buffer triz frio que sirve para el control del PH y así lograr ver las organelas vivas, también utilizamos un medio tecnológico que es la centrifugadora que sirve para poder separar las organelas . Así logramos estudiar las fracciones celulares

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

MATERIALES

-1 Mortero

-1 Gasa

- Tubos ependorf de 1,5Ml

-2 beaker de 100 ml

-100 ml  de Verde de Janus

-1 Cubetas con hielo

-1 beaker de 50 ml

-100 ml de Buffer Tris 10 mM pH 7,5

-1,5 ml de Colorante DAPI  

-1,5 ml de Mytotracker    

-1 caja de láminas y laminillas

-Microscopio de campo claro y fluorescencia

- Hígado de pollo

PROCEDIMIENTO:

1. Colocamos el  hígado  en  el  mortero frío,  tuvimos  que  moler  bien  y  de  extraer  los  ligamentos conjuntamente con la grasa. Realizamos  una pasta uniforme del hígado y seguidamente adicionamos 20 ml de la solución Tris 10 mM pH 7,5 el cual estuvo frio para ayudar en la regulación de PH. Con una gasa filtramos en un beaker limpio.
2. Transvasamos 250 µl del extracto a 2 tubos eppendorf y agregamos 500 µl de la solución de buffer Tris 10 mM pH 7,5. Rotulándose con el núcleo. Centrifugamos a 3000 rpm durante 3 minutos. (El pellet que ha quedado se denomina fracción nuclear y resuspendemos en 200 µl de Tris 10 mM pH 7,5).
3. Luego hicimos el procedimiento para lograr observar la fracción nuclear, para ello colocamos 10 µl del resuspendido del tubo marcado como núcleo , en una lamina porta objeto y le adicionamos una gota de azul de metileno y cubrimos con una lamina cubre objetos , procedimos a observar la muestra en el microscopio de campo claro , en la otra lamina usamos 10 µl de colorante de DAPI y cubrimos con una lamina cubreobjetos , lo dejamos reposar por 2 minutos y luego proseguimos a ver la muestra en el microscopio
4. Para la observación de mitocondrias , tomamos el tubo marcado como mitocondrias y un espendorf de o,5ml adicionamos un poco de lo resuspendido y también colocamos algunas gotas de colorante mytotracker dejamos que incube por 10 min a 37 ℃ . En otro ependorf realizamos el mismo procedimiento y adicionamos gotas de colorante verde de Janus. Realizamos un frotis y observamos la muestra con el microscopio de fluorescencia y de campo claro .
5. En todo el procedimiento utilizamos los pasos a seguir para conseguir el análisis de fraccionamiento celular , primero homogenizado , luego filtrado y por ultimo centrifugado  

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