El fraccionamiento celular

INTRODUCCIÓN

El fraccionamiento celular es una técnica de laboratorio utilizada para estudiar las funciones particulares de algún organelo. En ésta, las células u organelos se agrupan de acuerdo a sus funciones físicas y biológicas. Las etapas del fraccionamiento celular son Homogenización, filtrado, centrifugado. Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las técnicas adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y macromoléculas que la componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal propósito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza.

I. MARCO TEÓRICO:

El fraccionamiento celular permite separar los componentes de las células. Las membranas y organelos celulares suelen separarse mediante centrifugadoras, aparatos que hacen girar tubos de ensayo. Esto ejerce una fuerza centrífuga en el contenido de los tubos, que sedimenta las partículas suspendidas en la solución (como los organelos y membranas de células).

Algunas de estas partículas, como las mitocondrias, son organelos completos. Otras son pequeñas vesículas cerradas, llamadas microsomas, constituidas por membranas de Retículo Endoplasmático, complejo de Golgi y membrana plasmática. Después de la centrifugación algunas de las partículas forman un condensado en el fondo del tubo. Las diferentes partes celulares tienen densidad distinta, lo que permite separarla en fracciones celulares al centrifugar la suspensión a velocidad creciente (centrifugación diferencial).

Las membranas y los organelos de los condensados resuspendidos pueden purificarse después mediante centrifugación por gradiente de densidad, que se ilustra como el último paso en la figura. El condensado resuspendido se dispone en una capa en la parte superior de un gradiente de densidad, por lo general compuesto de una solución de sacarosa y agua. Dado que las densidades de los organelos y las membranas difieren, cada uno emigrará durante la centrifugación y formará una banda a una altura distinta en el gradiente.

II. OBJETIVOS:

• Identifica las fracciones celulares a partir de hígado de pollo.

• Deduce el rendimiento y pureza de cada fracción.

• Conoce la técnica de fraccionamiento celular para el estudio de las organelas celulares.

• Usa colorantes que identifiquen organelas específicas celulares.

• Distingue los tipos de microscopía de campo claro y fluorescencia en las muestras preparadas.

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

• MATERIALES:

• Mortero

• Gasa

• Tubos ependorf 1,5 mL

• 2 beaker de 100 mL

• Verde de Janus

• Cubetas con hielo

• 1 beaker de 50 ml

• Buffer Tris 10 mM pH 7,5

• Mytotracker

• Microscopio de campo claro

• Microscopio de campo oscuro de florescencia

• Colorante Hoecst 33258

IV. PROCEDIMIENTO:

• Primero colocamos el hígado en el mortero, luego lo molemos bien. Seguidamente adicionamos 20 ml de solución de Tris 10 mM pH 7,5. Con una gasa filtramos en un beaker limpio.

• Transvasar 250 μL del extracto a 2 tubos eppendorf y agregue 500 μL de la solución de buffer Tris 10 mM pH 7,5. Colocarle la palabra núcleo. Centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos. El pellet resuspender en 200μL de Tris 10 mM pH 7,5.

• Colocamos el sobrenadante del proceso anterior a 2 ependorf nuevos y colocamos la palabra mitocondrias. Centrifugamos a 10000 rpm durante 8 minutos. Eliminamos el sobrenadante y resuspendemos el pellet en 200 μL de buffer Tris 10 mM pH 7,5.

• Colocamos 10 μL del resuspendido del tubo que dice núcleo, en una lámina porta objeto y le adicionamos una gota de azul de metileno y lo cubrimos con una lámina cubre objeto. Observamos en el microscopio de campo claro. En otra lámina adicionamos 10 μL del colorante Hoechst 33258 y cubrir con una lámina cubre objeto, dejar reposar 2 minutos y observar en el microscopio de fluorescencia.

• Tomar el tubo que tiene la palabra mitocondria y en un ependorf de 0,5 ml adicione 5 μL del resuspendido y 5 μL del colorante mytotracker dejándolo incubar por 10 minutos a 37°C. En otro ependorf de 0,5 realizamos la misa operación y adicionamos 5 μL del colorante verde de Janus, realizamos un frotis

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