FRACCIONAMIENTO CELULAR

El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioquímica y fisiología de organelos fuera del ambiente complejo de la célula intacta. El objetivo principal de este experimento es aislar los cloroplastos, núcleo y mitocondria del tejido de plantas por el método de fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscópicamente y estimar el coeficiente de sedimentación de los cloroplastos.

HOMOGENIZACIÓN

Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado(una solución amortiguadora, salina ó azúcar isotónica). Para mantener la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionación , todas las soluciones y cristalería debe mantenerse frías. Después de rebanar las hojas, el tejido está preparado para la homogenización, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin dañar el medio en suspensión. La suspensión de células constituyentes se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenización se debe realizar con un mortero(fig.1), al cual se le añade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos se aislarán de la espinaca; núcleos y mitocondria se aislarán de la coliflor.

CENTRIFUGACION

Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una fuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa(RCF)en unidades de g. La RCF es una función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuación : RCF = 1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotación hasta el margen de afuera del tubo de centrífuga.

CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

En la centrifugación diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades ,sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. El método está ilustrado en la fig. 2. La primera centrifugación es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear. Este “pellet” contiene el núcleo, células intactas y tejido.. L próxima separación es el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobre el “pellet” nuclear, el cual es tranferido a otro tubo de centrífuga y se centrífuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrífuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fracción mitocondrial ; éste contiene mitocondria y micro cuerpos.

Los cloroplastos de las células de espinaca se aislarán utilizando el método modificado de F.R Whatley y D.I.Arnon (1962). La espinaca se homogeniza en un amortiguador de sal.

...