Amplificación de ADN vegetal o bacteriano.

Reporte de amplificación de ADN vegetal o bacteriano para observar la reacción en cadena de la polimerasa

Iris Estefania Moreno Garica / Evelyn Yveth Juarez Perez

Introducción

Los ácidos nucleicos y las proteínas, macromoléculas comunes a todos los seres vivos, cambian con el tiempo. Por ello, pueden considerarse como cronómetros moleculares o documentos de la historia evolutiva. En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especies para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN con o sin función conocida que proporcionan información sobre la variación y permiten distinguir individuos (Schlötterer 2004). Estos marcadores se obtienen con técnicas como la PCR (por las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction) y secuenciación, que hacen posible analizar la variación en la molécula del ADN con un detalle sin precedentes (Schlöttlerer 2004; Hudson 2008). Los datos moleculares han permitido estudiar con mayor precisión los patrones de diversidad genética y su distribución; el comportamiento; la selección natural; las interacciones biológicas; la composición, funcionamiento y dinámica de comunidades microbianas; las relaciones filogenéticas, entre otros (Sunnucks 2000; Schlötterer 2004; Hudson 2008). La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN y la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la extracción de ADN íntegro y puro.

A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de problemas que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN.

Objetivos
Amplificación de ADN bacteriano, reacción de la polimerasa y de la retro transcriptasa.

Materiales y Métodos

Este protocolo está diseñado para la amplificación de fragmentos estándar que no sobrepasan las 2 kb (dos mil bases). Es necesario seleccionar previamente la o las regiones a amplificar así como seleccionar o diseñar los iniciadores, de acuerdo con los objetivos de la investigación. Asimismo se deben establecer las condiciones de amplificación de la PCR y las concentraciones de los reactivos.

Equipo

• Termociclador
• Vortex
• Micropipetas de 2, 20, 100 y 200 µl,
• Microcentrífuga
• Fotodocumentador

Material

• Guantes desechables de látex, vinil o nitrilo
• Tubos para PCR
• Puntas para micropipetas
• Baño de hielo
• Gradilla

Reactivos

• Muestra de ADN que contenga la región(es) que se desea amplificar
• Buffer o solución amortiguadora
• Cloruro de Magnesio (MgCl2)
• Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
• Iniciadores
• Taq polimerasa
• Agua destilada o desionizada estéril

Procedimiento  

1. Preparación de la muestra. En un tubo para PCR se agregan los siguientes reactivos: el ADN molde, los iniciadores, los nucleótidos o dNTPs, la solución  amortiguadora el cloruro de magnesio (MgCl2), el agua y la ADN polimerasa. (Tabla 3), pueden agregarse otros compuestos que ayudan a la estabilidad de la polimerasa.

1. Mezclar los componentes de la reacción con un vórtex durante 2-3 segundos o dando unos golpecitos con el dedo o invirtiendo el tubo varias veces (Stirling 2004).
2. Centrifugar brevemente para reunir la mezcla en el fondo del tubo.

[pic 1]

2. Amplificación. Colocar las muestras en el termociclador programado con las condiciones de amplificación establecidas previamente.

...