Análisis del DNA

Universidad de las Américas

Nombre: Daniela Arcos

IBT504-2

Análisis del DNA

 La purificación, identificación, análisis y separación de los fragmentos de DNA, son posibles gracias al uso de geles de agarosa y poliacrilamida en la electroforesis; en estos geles la ubicación de las bandas de mínimo 20pg de DNA se llegan a conocer por la tinción intercalada que generan los colorantes fluorescentes, las cuales se detectan empelando luz UV.

Los  geles de poliacrilamida y agarosa existen en diferentes tamaños, formas y porosidad; la elección del mismo depende del tamaño de los fragmentos que se desean obtener. Para la obtención de fragmentos pequeños es más efectivo el gel de poliacrilamida que el de agarosa que permite la obtención de fragmentos de mayor tamaño, no obstante la preparación y manipulación del gel de poliacrilamida es más compleja.

Existen varios factores que determinan la velocidad de migración del DNA e través de geles de agarosa, entre estos están:

• El flujo eléctrico constante a través del gel→ La molécula de DNA se mueve a una rapidez influenciada por la corriente eléctrica, llevando su carga negativa hacia el ánodo.
• El tamaño molecular del DNA→ Las moléculas de doble cadena del DNA migran a través de la matriz del gel y debido a la fricción la migración de las moléculas grandes de DNA se da más despacio que las pequeñas.
• La concentración de agarosa→ Los puentes de hidrogeno e interacciones hidrofóbicas son los que permiten la unión de los geles de agarosa y  los poros permiten la fragmentación del DNA; el diámetro de estos poros está determinado por la concentración de la agarosa en el gel.
• Conformación del DNA→3 formas: superhelical circular, circular cortado y lineal; la velocidad de migración de los mismos depende de ciertas condiciones.
• La presencia de colorantes en el gel y el buffer de electroforesis→ La disminución en la carga negativa del DNA y el aumento de rigidez, puede ser causado por la presencia de colorantes en la molécula.
• El voltaje aplicado→ A medida que el voltaje aumenta, la migración se acelera para los fragmentos de alto peso molecular; por lo tanto, la migración es proporcional al voltaje.
• Tipos de agarosa→ Hay dos tipos de agarosa: agarosa estándar y agarosa que se diluye a bajas temperaturas.
• El buffer de electroforesis→ La conductividad eléctrica es reducida ante la ausencia de iones y así la migración del DNA se vuelve más lenta, mientras que si el buffer tiene alta carga iónica, la migración es más acelerada y se liberan altas cantidades de calor.

Clases de agarosa y propiedades

• Agarosas estándar→ Empleadas para asilar fragmentos de DNA entre 1kb y 25kb.
• Agarosas con bajo punto de fusión y gelificación→ La recuperación acelerada del DNA, requiere uno de estos geles, eso permite una purificación y procesamiento enzimático más sencillos.
• Agarosa químicamente modificada→ el tamizado con agarosa modificada químicamente es más eficaz que con una agarosa estándar, lo cual incentivó el uso de geles de poliacrilamida en PCR, gracias a este descubrimiento.
• Electroendo-osmosis→ es el factor que determina la velocidad de migración de los ácidos nucleicos hacia el electrodo positivo, a causa de la unión de la matriz polisacárida con los grupos acídicos ionizados en el gel de agarosa.
• Buffers de electroforesis→ existe una gran gama de buffers disponibles para electroforesis de DNA de cadena doble, estos contienen en sus componentes Tris-acetato y EDTA (TAE), Tris borato (TBE) y Tris fosfato (TPE), entre estos el de menos capacidad tamponante es TAE, razón por la que su precio es menor que TBE y TPE, pues estos son mejores tamponantes; más el poder de resolución de TAE para las moléculas de DNA de alto peso molecular es mejor.
• Buffer de gel de carga→ sirven para: un aumento en la densidad de la muestra, asegurar el ingreso del DNA en los sitios en que se agrega esta molécula y simplificar el proceso de carga.

Análisis de los fragmentos de DNA: Una vez separado el DNA mediante electroforesis, se emplean tinciones para la detección de estos fragmentos. Para una examinación más profunda, pueden recubrirse los fragmentos a partir del gel.

Anteriores análisis de DNA mediante electroforesis

Vin Thorne fue quien propuso la unión de dos fuerzas: fracción y eléctrica, para la separación en diferentes formas y tamaños de la molécula de DNA marcadas radioactivamente, esto despertó un interés general, hasta que en 1972, Aauj y Borst  realizaron un procedimiento en el que se sumergió el gel en una solución con el colorante concentrado y una posterior destinción para reducir la fluorescencia en el fondo; sin embargo pudieron darse cuenta no mucho tiempo después de que el colorante puede ser incorporado al gel y este ser corrido sin causar afecciones significativas en los fragmentos de DNA línea; lo siguiente fue el desarrollo de los aparatos para electroforesis por Schaffner, quien se dio cuenta que la resistencia del buffer es la misma que el gel de agarosa, sin embargo las personas recibieron esto con mucho escepticismo hasta que lograron comprobar su funcionamiento y dejar de usarse geles cilíndricos, que era algo empleado anteriormente, para darle paso a los nuevos geles “submarino” que tuvieron gran aceptación.

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