Análisis De DNA Genómico Y Electroforesis En Gel De Agarosa Para ácidos Nucleicos.

Las células son las unidades funcionales de cualquier organismo vivo. Las instrucciones necesarias para dirigir sus actividades están contenidas en los cromosomas del núcleo celular y son conocidas en su conjunto como información genética. La información genética se encuentra almacenada en el acido desoxirribonucleico (DNA) en forma de un código, denominado código genético.

Los procesos celulares involucrados en la transferencia y transmisión de la información genética en la célula constituyen la materia de estudio de la biología molecular. La biología molecular puede ser definida como una disciplina que se ocupa del estudio de la vida a nivel molecular.

Para el estudio de la transferencia y la transmisión de la información genética, los biólogos moleculares han desarrollado técnicas que permiten la manipulación de los ácidos nucleicos (DNA y RNA), denominadas técnicas del DNA recombinante; con este mismo fin han propuesto y perfeccionado procedimientos para el estudio de los productos de la expresión de los genes (RNA y proteínas).

La medicina molecular es la ciencia biomédica que utiliza las técnicas de la biología molecular en el estudio de las enfermedades humanas. La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN.

El DNA puede obtenerse de varias fuentes como sangre, tejidos frescos, congelados o embebidos en parafina, células en cultivo, líquidos corporales, entre otros. Existen diferentes procedimientos de extracción, pero en general los pasos que se siguen son los siguientes:

1. Lisis celular y desnaturalización de proteínas

2. Desproteinización

3. Precipitación de DNA y su resuspensión

4. Análisis de calidad y cantidad de DNA

• Técnica de TSNT

En el método de TSNT se realiza la lisis celular por la acción desnaturalizante de los de SDS y Tritón X 100. Las proteínas desnaturalizadas son extraídas con fenol y Sevag (cloroformo + alcohol isoamílico 24:1). Se recupera la fase acuosa y se precipita con etanol. El DNA obtenido se lava con etanol 70% y disuelve en solución amortiguadora de Tris-EDTA (tampón TE).

El DNA obtenido se puede evaluar mediante electroforesis en gel de agarosa o por espectrofotometría UV, entre otros.

• Análisis de DNA por espectrofotometría

El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mononucleótidos pueden cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A de luz ultravioleta. Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, la medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta. En este método, los tampones acuosos con escasa concentración iónica (por ejemplo, tampón TE) resultan idóneos. La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco.

La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un «cociente». Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1.8 y 2.0. Si la muestra también contiene proteínas, el cociente A260/A280 será considerablemente inferior a dichos valores y no podrá determinarse con exactitud la cantidad de ácidos nucleicos.

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