Analisis de biomoleculas por espectrofluorescencia.

Aplicación de la espectroscopia de fluorescencia en el análisis de Biomoleculas

Una de las áreas de investigación que se han visto muy beneficiadas con el uso de fluorescencia es el estudio de función y estructura de las proteínas. Existen tres aminoácidos aromáticos que absorben luz en el rango del espectro ultravioleta, fenilalanina, tirosina y triptófano. Debido a su absortividad molar la tirosina (am a 276nm=1405 M-1 cm-1) y triptófano (am 280nm =5579 M-1 cm-1) han sido muy usados para el estudio de proteínas. Usualmente el número de residuos de triptófano es limitado y existen diversas proteínas que sólo tienen un triptófano. El presentar un valor de absortibidad molar mayor que la fenilalanina y la tirosina, le permite una excitación preferencial en una proteína. Debido a las propiedades electrónicas del triptófano, las interacciones intramoleculares selectivas pueden llevar a un aumento o apagamiento de la fluorescencia. Estas características proveen información sobre la estructura molecular alrededor del triptófano. Obviamente, si hay varios residuos de triptófano en la proteína se dificulta la interpretación del comportamiento individual. Debido a los problemas que ocasiona el encontrar más de un triptófano, se usan análogos como 5-hidroxitriptófano y 7-azatriptófano, los cuales son substituidos en proteínas en lugar de los residuos de triptófano normales. Estos análogos presentan espectros característicos que permiten la excitación selectiva y pueden dar información útil en detalles moleculares de interacción de complejos proteína-proteína y proteína- ácidos nucleicos. Una aplicación práctica de los análogos de triptófano fue el incorporar 5-hidroxitriptófano a la insulina. La molécula fue funcional, fluorescente y es útil para realizar estudios de interacción entre la insulina y su receptor.

Las aplicaciones también abarcan a los ácidos nucléicos. Se han reportado mediciones del decaimiento de la fluorescencia de oligonucleótidos y polinucleótidos de doble cadena usando la fluorescencia intrínseca de la timina excitada a 293 nm. Lo cual provee evidencia de grandes movimientos en el DNA con tiempos de correlación de nanosegundos. También se han estudiado las interacciones entre proteínas y DNA.

 Otra aplicación de los métodos fluorométricos es para el estudio de las membranas celulares se basan en procesos como el apagamiento de la fluorescencia. La finalidad de estos métodos es detectar la fusión de los lípidos de membrana o de otros componentes de las entidades fusionadas. Una de las técnicas usadas es la transferencia de energía entre NBD y rodamina. En este método, se mezclan células marcadas con una combinación de sondas con donadores y aceptores que se unen a lípidos y células no marcadas. Normalmente se usan N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (NBDPE) como donador y Rodamina β 1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, trietilamonio (N-Rh-PE) como aceptor. Se excita a NBD-PE a 470 nm aproximadamente y éste a su vez logra la emisión de la rodamina a 585 nm. Cuando las membranas se fusionan la distancia entre ambos aumenta y por lo tanto la emisión de la rodamina disminuye. Esta técnica, puede usarse para hacer estudios de cinética, sobre la entrada de virus a las células por fusión de membrana, o la entrada y salida de componentes a diferentes vesículas o membranas.

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