Bioquimica. Preservación de muestras biológicas

TEMA: 3

1.-Preservación de muestras biológicas

Para preservar muestras biológicas, primero hace falta la extracción (homogeneciación) de la muestra, es decir hace falta desmembrar o separar el tejido o la célula. Tras esto hace falta preservar las muestras: Al frio 4ºC, congelación -20ºC, ultracongelación (con nitrógeno líquido) -196ºC. Si se usa el tercero, tras la ultracongelación mediante el nitrógeno líquido se debe meter la muestra en un ultracongelador que mantiene la temperatura de -80ºC

2.-Homogeneización mecánica

Tras esto, como la muestra está congelada, se mete en un mortero hasta obtener un polvo. Pero como no todos los tejidos son iguales, hay tejidos duros pero que no están congelados, con estos se usa una especie de batidora de laboratorio, si la muestra es muy pequeña y blanda no se usa ninguno de los dos, se usa un “potter” para romper el tejido.

3.-Ruptura de células

→Mediante una “prensa francesa” que sirve ara tejidos líquidos. Al introducir este líquido, se ejerce una presión tan fuerte que revienta las células u orgánulos

→El “ultrasonido” también rompe las membranas haciendo estallar orgánulos o células sueltas

→Otra forma de romper el tejido (método químico) es con la lísis alcalina que se usa para romper las membranas de las bacterias o el DNA plasmídico

4.-Medio de extracción

Para extraer la muestra se utiliza un medio específico, el tampón de extracción (al homogeneizar se obtiene una pasta, con esto, obtienes un líquido): Hay que añadir al tampón todas las sustancias para que las proteínas que quieras estudiar estén “cómodas”, pH adecuado, presencia o ausencia de sales, inhibidores de proteasas, antioxidantes para que no se oxiden las proteínas (como el 2-mercaptoetanol o el ddt; Algunas se oxidan al contacto con el aire), EDTA…

Ejemplo: En un experimento con fresas: Primero hay que extraer o romper la fresa añadiendo un disolvente adecuado en el que la muestra pase a una fase líquida, es decir para extraer hace falta un tampón acuoso. AGUA, ya que es una molécula polar (los 2 H están más juntos entre sí  y por tanto los dipolos positivos se encuentran a un lado y el negativo a otro), no tiene carga (se contrarrestan las cargas del O y de los H), tiene puentes de H (debido a la atracción electrostática entre las cargas), es el disolvente universal, en estado líquido es una molécula antipática (sus dos extremos tienen características diferentes, los H  son apolares y el O polar), el agua pura tiene un bajo grado de ionización (pH 7, es decir, natural, esto influye mucho en disoluciones y eq. químicos), tiene un pequeño calor específico y elevado punto de fusión y ebullición

Constante de equilibrio (Keq)

Que el agua pura esté ionizada implica que hay siempre un equilibrio dinámico (es decir que la molécula de agua está constantemente ionizandose y desionizándose) La constante de equilibrio de una reacción cualquiera es:

[pic 1]

A partir de ahí se puede deducir la constante de equilibrio del agua:

[pic 2]

Y también la Keq cuando una solución es neutra:

[pic 3]

El pH es una forma conveniente de expresar la concentración de H+ ya que los resultados de las fórmulas anteriores son un poco liosos.

[pic 4]

Por ejemplo una solución neutra:

[pic 5]

Las concentraciones de H+ y OH- se representan por la escala del pH:

[pic 6]

El pH de una disolución o un compuesto puede medirse a través de un pHmetro, o a través de los indicadores del pH (que pueden ser un líquido que se le arroja a la disolución y según el color es un pH→ fenolftaleina, o en papeles indicadores del pH)

Factores que afectan a la solubilidad:

Los factores principales que afectan a la solubilidad son el pH y la temperatura (que es una de las dificultades de las proteínas, ya que se desnaturalizan)

Influencia del pH en las disoluciones:

Por ejemplo, los ácidos y bases tienen constantes de disociación características:

[pic 7]

Así por tanto se deduce que los ácidos fuertes, están muy ionizados y por tanto Ka es muy grande (HCl) y por el contrario, en ácidos débiles, la Ka es muy pequeña ya que están poco ionizados (ácidos acético).

Una forma conveniente de usar Ka es mediante la fórmula:   pKa= -logKa

(Al aplicar esto salen números bajos porque los ácidos son del 1-6 en la escala de pH)

Por tanto de aquí se deduce que: Al disminuir pKa, disminuye el pH (ácido) y al aumentar pKa, aumenta al pH (básico)

5.-Solubilidad y grupos ionizables

Pongamos el ejemplo de un Aminoácido. Si intentamos subir el pH de un Aa al rato acabaremos alcanzando el pKa del Aa, si al alcanzarlo sigues añadiendo sosa, el Aa tiene que compensar esa protonización (rompe p. de H y desnaturaliza la proteína), así que su COOH pierde un H+ y queda desprotonizado (COO-). Si aún así sigo subiendo el pH y sigo protonizndo la proteina, acabaré alzanzando el pKa2 del Aa y por tanto se desprotoniza el NH3 quedando como NH2+ (zwitterion). Pasa a tener carga neta.

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