COMO SE DA EL TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 ELECTROFORESIS EN GEL, SDS-PAGE

TRABAJO PRÁCTICO Nº 4

ELECTROFORESIS EN GEL, SDS-PAGE

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INTRODUCCION

Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución, las moléculas de soluto con carga neta positiva se desplazan hacia el cátodo y las moléculas con carga neta negativa se desplazan hacia el ánodo; este desplazamiento se denomina electroforesis. La velocidad de las moléculas depende de dos factores; conduciendo el movimiento está la fuerza ejercida por el campo eléctrico sobre la partícula, y resistiendo el movimiento está la fuerza de fricción que ejerce el entorno sobre la partícula, que depende del tamaño y de la forma de las moléculas. Las moléculas grandes o asimétricas encuentran más resistencia de fricción que las moléculas pequeñas o compactas, y por tanto tienen unos coeficientes de fricción mayores.

Cuando se activa el campo eléctrico, la molécula se acelera rápidamente hasta alcanzar una velocidad en la que estas fuerzas se equilibran y luego se mueven constantemente a esa velocidad. De allí, que la movilidad de una molécula dependerá de su carga y de las dimensiones moleculares, dado que los iones y macroiones difieren en ambos aspectos, su comportamiento en un campo eléctrico proporciona una buena manera de separarlos. La separación electroforética es uno de los métodos más utilizados en bioquímica.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

1.- Conocer de manera generalizada el procedimiento de electroforesis SDS-PAGE.

2.- Calcular el factor de corrida de las proteínas del marcador de PM y de las muestras problemas.

3.- Calcular el PM de las proteínas de las muestras problemas.

LABORATORIO:

1. En el laboratorio se aislaron las fracciones de albúminas y de globulinas a partir de dos variedades de semillas de caraotas (Phaseolus vulgaris; variedades blanca y negra) y de haba de burro (Canavalia ensiformis). A alícuotas (10 µl; 20 µg de albúminas; 10 µg de globulinas) de cada uno de los extractos, se les añadió dodecilsulfato de sodio (SDS), β-mercaptoetanol (β-ME y azul de bromofenol (ABF) en cantidades apropiadas. Las distintas muestras se colocaron en un baño de agua hirviendo por 3 min y luego se colocaron en los diferentes bolsillos de un gel plano poliacrilamida (gel de apilamiento).

Mediante la aplicación de un voltaje y amperaje apropiado, las muestras penetraron en el gel de apilamiento; después de cierto tiempo las distintas muestras se concentraron en una banda definida en el gel de apilamiento. Seguidamente se aplicaron otras condiciones de voltaje y amperaje para que las proteínas entraran en el gel separador (poliacrilamida al 0,10). Toda la corrida electroforética se realizó con un sistema de buffer discontinuo, el cual contenía SDS y β-ME en concentraciones similares a las presentes en las muestras.

La corrida electroforética

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