Cuantificacion Plásmido PGLO

Práctica: Determinación de pérdida de plásmido pGLO en E. coli en diferentes condiciones de cultivo.

Resultados: Se usó la cepa BL-21 de Escherichia coli que fue transformada con el plásmido pGLO, para analizar la pérdida de plásmido por factores determinantes como lo fueron: diferentes condiciones de cultivo, como fue la presencia de ampicilina y/o arabinosa en el medio, la temperatura (37°C o 25°C) y la agitación. Se calculó la pérdida de plásmido al contar 100 colonias, obteniendo el porcentaje de colonias sin la presencia de luminiscencia bajo luz U.V. que indica la ausencia de expresión de GFP. Se calculó el tiempo de duplicación de cada condición de cultivo en los diferentes matraces cada 2 horas leyendo absorbancia a 600 nm.

Matraz 5

Hora Número de lista Absorbancia a 600 nm UFC % de pérdida de plásmido

0 27 0.040 CNS 39

2 32 0.073 CNS 33

4 9 0.210 CNS 35

6 16 0.288 CNS 28

8 13 0.310 CNS 22

10 26 0.319 CNS 29

26* CNS: Colonias no separadas. 55

Tabla 1: Corresponde a los valores obtenidos en cuanto a la condición aplicada al matraz 5, el cual estuvo a 37°C en la incubadora, sin agitación, no hubo presencia ni de ampicilina ni arabinosa. La tercera columna muestra las absorbancias obtenidas al leer al espectrofotómetro a 600 nm cada 2 horas incluyendo la hora 0 hasta la hora 10, mostrando de forma evidente el incremento de absorbancia conforme transcurrían las horas. Fue imposible el conteo de las UFC (columna 4) puesto que no se obtuvieron colonias separadas, y la pérdida de plásmido fue decreciendo, por lo que a la hora 10 hubo un mayor número de células con plásmido.

Figura 1: Se muestra una gráfica de absorbancia a 600 nm con medición a cada 2 horas correspondiente al matraz 5. La gráfica corresponde a una cepa de E. coli con condiciones de fermentación delimitadas ya antes mencionadas. Se observan las diferentes fases de crecimiento del organismo. La fase lag va de la hora 0 a la 2 y la fase log comienza a partir de la segunda hora hasta la hora 6, donde entra a log tardía y posteriormente a fase estacionaria. Se anexa ecuación de regresión y el coeficiente de determinación.

Figura 2: Se presenta una gráfica del Matraz 5 de E. coli al calcular el porcentaje de UFC sin GFP, es decir, que ha perdido el plásmido. Se graficó en base al tiempo de fermentación, cada dos horas, mostrando que la pendiente es negativa, pues, al aumentar valores de X los valores de Y disminuyen, por lo que la pérdida de plásmido fue disminuyendo. Sin embargo, esta orientación no es completamente lineal, pues se observa que a la hora 4 y a la hora 10 aumentó la pérdida de plásmido contrastando al resultado anterior a esos puntos.

Matraz 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Td (h) 2.64 19.1 3.41 4.01 22.25 3.59 17.69 3.98 3.83 15.68

Porcentaje de pérdida plásmido en la hora 0. 36 21 33 51 39 25 17 50 32 16

Porcentaje de pérdida plásmido en la hora 10. 20* 7.7* 49 22 29 23 1.2** 32 46 28

Tabla 2: Se muestran los tiempos de duplicación de cada condición de cultivo en la que se trabajó, es decir, los 10 matraces. Se observa que el matraz 5 que estuvo a 37°C sin agitación y sin presencia de arabinosa y ampicilina obtuvo un mayor tiempo de duplicación, mientras que el matraz 1 que se incubó a 37°C en agitación, con presencia de ampicilina y arabinosa mostró un menor tiempo de duplicación, comparados con los matraces restantes. El porcentaje de pérdida de plásmido disminuyó al transcurso de las horas en los matraces 1,2,4,5,7 y 8, mientras que aumento en los matraces 3,9 y 10, por otra parte el matraz 6 se mantuvo estable a lo largo del paso de las horas.

Discusión: Se utilizó el plásmido pGLO para transformar la cepa bacteriana BL-21 de E. coli de la compañía Bio-Rad, así se tenía la proteína GFP de la medusa Aequoria victoria que se codifica por un gen gfp. Esta proteína se puede observar mostrando fluorescencia al estar bajo la luz UV y se muestra de color verde brillante, gracias a esto, es posible utilizarla para identificar células que producen gran cantidad de esta proteína. El gen gfp contiene además un par degenes, uno de los cuales codifica para B-lactamasa que le confiere

...