DEBER GENÉTICA MOLECULAR TEMA: Estructura del plásmido

Nombre: Jocelyne Morales Coronel [pic 1]

Grupo: N°2

Nivel: 7mo Semestre

DEBER GENÉTICA MOLECULAR

TEMA: Estructura del plásmido

1. Plantee un experimento en donde ocupe la técnica de clonación.

Clonación del gen APOE mediante el uso del plásmido pBabe-GFP para obtener colonias recombinantes de la bacteria Agrobacterium Tumefaciens para obtener una mayor expresión de la apolipoproteína E.

2.

• Objetivo a clonar: gen APOE
• Tamaño del fragmento a clonar: 244 pb

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Plásmido: pBabe-GFP

Características del plásmido: Es un plásmido retroviral

• El plásmido tiene un peso de 5169pb.
• Posee un gen de resistencia a la ampicilina (Amp).
• Cuenta con el origen de replicación (ORI).
• Se le añadió como gen reportero GFP (proteína verde fluorescente).
• El sitio LTR (región terminal repetida larga) funciona como un sitio de control y regulación.

Enzima de restricción a utilizar:

La EcoRI es una endonucleasa, que pertenece a las enzimas de tipo II, las cuales:

• Sólo tienen actividad de restricción.
• Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
• Sólo requieren Mg++ como cofactor.
• No necesitan ATP.

Para el caso de EcoRI, este se nombra de la siguiente manera:

• E= Genero Escherichia.
• co= especie coli.
• R= cepa RV 13.
• I=primera endonucleasa aislada de esta cepa.

(Maldonado, s.f.)

El corte se va a dar en el sitio de reconocimiento:[pic 13]

• Se puede observar que EcoR1 deja extremos cohesivos

4. Explicar el proceso de recombinación y transformación

1. Digestión enzimática:

Proceso de corte con enzima de restricción EcoRI en el sitio de reconocimiento del plásmido, dejando extremos cohesivos para la posterior ligación.

1. Ligación:

Al tener extremos cohesivos el plásmido se va a cerrar por complementariedad de bases y con la ayuda de un ADN ligasa la unión va a quedar estable.

1. Transformación:

• Cultivo de Agrobacterium tumenfaciens en agar nutritivo para obtener las bacterias a las cuales se les va a insertar el plásmido.
• Se toma 20uL del plásmido con el gen de interés.
• Se incuba a 37°C y 180 rpm con Agrobacterium al cual se le aplica un choque térmico para permeabilizar la membrana y facilitar la entrada del plásmido.
• El gen de interés se incluirá en el genoma de la bacteria transformada.

1. Selección:

• Se realiza un medio de cultivo selectivo con ampicilina.

5. Cómo identifico las bacterias transformadas recombinantes.

Al cultivar Agrobacterium tumefaciens luego del proceso de transformación en un medio de cultivo selectivo con ampicilina ya que el plásmido posee resistencia a este antibiótico, además de que posee el gen reportero GFP el cual indicara fluorescencia si las bacterias no poseen el inserto y las colonias no presentaran fluorescencia si tienen el inserto.

Posteriormente se realizará la selección de las colonias que crecieron en ampicilina y no presentaron fluorescencia, obteniendo así los clones recombinantes o transformados.

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