DETERMINACIÒN DEL SEXO A PARTIR DE UN FROTIS DE LA MUCOSA ORAL

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Diario de prácticas 3er TRIMESTRE

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1. Índice

1. DETERMINACIÒN DEL SEXO A PARTIR DE UN FROTIS DE LA MUCOSA ORAL

INTRODUCCIÓN

MATERIAL NECESARIO.REACTIVOS.

PROCEDIMIENTO

RESULTADOS

1. DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh POR PCR

INTRODUCCIÓN

MATERIAL NECESARIO. REACTIVOS.

PROCEDIMIENTO.

RESULTADOS

1. DIGESTIÓN DEL FAGO LAMBA CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.

INTRODUCCIÓN

MATERIAL NECESARIO.REACTIVOS

PROCEDIMIENTO

RESULTADOS

1. TRANSFORMACIÓN BACTERIANA CON pGAL.

INTRODUCCIÓN

MATERIAL NECESARIO. REACTIVOS

PROCEDIMIENTO

RESULTADOS

1. ELECTROFORESIS.

INTRODUCCIÓN

MATERIAL NECESARIO. REACTIVOS

PROCEDIMIENTO

RESULTADOS

DETERMINACIÓN DEL SEXO A PARTIR DE UN FROTIS DE LA MUCOSA ORAL.

→ INTRODUCCIÓN

En el ser humano, el cromosoma Y es el que va a determinar el sexo. El complemento cromosómico de una célula somática es 46, XX sexo femenino y 46,YY masculino. En el sexo femenino se da la inactivación de uno de los dos cromosomas, X, que microscópicamente se traduce como una masa heterocromática, dicho corpúsculo de Barr o cromatina X.

→ MATERIALES NECESARIO. REACTIVOS.

• Portaobjetos.
• Cubreobjetos.
• Torundas de algodón.
• Microscopio de campo claro.
• Solución de orceína acética al 2% y alcohol etílico al 95%.

→ PROCEDIMIENTO.

Para la obtención de la muestra de mucosa oral realizaremos un raspado sin sangrado de la parte interna de la mejilla con una torunda o hisopo durante unos breves segundos.

La extensión celular, realizamos un frotis de la muestra en un portaobjetos limpiado con alcohol etílico al 95%, formando una capa poco gruesa. Secar al aire de 5 a 10 mins.

Para la fijación de la muestra, introduciremos el portaobjetos en alcohol etílico al 95% durante 5 mins. Colocamos 1 gota de orceína acética y tapamos con un cubreobjetos. Dejamos actuar durante 15-20 mins.

Sobre la preparación, realizaremos un aplastado de las células con ayuda de un papel de filtro con el que limpiaremos lo sobrante.

A continuación, retiramos el papel de filtro impregnado del exceso de colorante.

Observamos al microscopio con todos los objetivos, hasta llegar al de 100x con el aceite de inmersión.

→ RESULTADOS.

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DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh POR PCR.

→ INTRODUCCIÓN.

La PCR es un proceso simple, exacto y altamente reproducible que proporciona la ventaja de empezar con una pequeña cantidad de ADN y ser capaz de amplificar de forma que se tenga suficiente para realizar experimentos.

En todos los casos se amplifican segmentos de ADN que posteriormente son sometidos a análisis y estudios varios.

Rhesus, conocido como factor Rh, es un antígeno o proteína presente en los glóbulos rojos de determinadas personas. Los individuos que presentan dicha proteína en sus eritrocitos son Rh+ y quienes no poseen la misma son Rh-. Por tanto, los individuos son clasificados como Rh+ si contienen el antígeno D en la membrana de sus eritrocitos.

→ MATERIAL NECESARIO. REACTIVOS.

• Guantes.
• Papel de filtro
• Microtubos
• Micropipetas
• Puntas de micropipeta
• Termociclador x2
• 22,5 microL MIX PCR
• 2,5 microL ADN.
• Geles de electroforesis x4:

- 1,5 gr Agarosa.

- 100ml Tampón de electroforesis concentrado al 10x

- 20 microL Control positivo Rh+

→ PROCEDIMIENTO.

Utilizaremos 2,5 microL (100-250 ng) del ADN aislado de la saliva de cada componente del grupo para cada reacción de PCR.

ATENCIÓN:

• Preparar un control negativo de amplificación, para ello colocar 2,5 microL de agua libre de nucleasas en lugar del ADN, esto sirve para saber si los reactivos o micropipetas y puntas pueden estar contaminados con ADN. En el control negativo no se tiene que amplificar.
• Preparar un control positivo de amplificación, para ello colocar 2,5 microL de control positivo Rh+ en lugar del ADN.

Mezclar bien el colorante rojo incluido la polimerasa, facilitando el proceso.

Para aquellos termocicladores que no tengan un “heated lid”, añadir 25 microL de aceite mineral para prevenir la evaporación.

Realizar el proceso de amplificación.

ATENCIÓN: Para la activación de la Polimerasa “HOT STAR” es necesario programar un paso de desnaturalización inicial de 10 mins a 95%C, después programar los 30 o los 40 ciclos específicos de cada producto a amplificar.

El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en un gel de agarosa después de la PCR, ya que el colorante rojo actúa como tampón de carga.

Para la tinción y detección de las bandas de ADN en el gel de electroforesis, utilizaremos Danablue o GelSafe.

Se puede calcular la frecuencia observada de los diferentes polimorfismos en la clase

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Podemos observar que en el análisis de PCR de diferentes muestras de nuestros compañeros de clase para la determinación del Rh, que las bandas no se ven y si lo hacen es de forma leve y casi no se puede apreciar al aplicarle el transiluminador. En conclusión el resultado se considera nulo y se debería de volver a repetir pero con otros métodos de tinción para poder observar las bandas correctamente.

DIGESTIÓN DEL FAGO LAMBDA CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

→ INTRODUCCIÓN

En esta práctica, veremos el método de digestión del ADN con enzimas de restricción hasta su visualización en gel de electroforesis, usando como vector de clonación al fago lambda.

→ MATERIAL NECESARIO. REACTIVOS.

• Gel de electroforesis.
• Papel de filtro
• Micropipetas
• Vaso de Erlenmeyer 100ml
• 450 ml Agua destilada.
• 100 ml tampón de electroforesis 10x
• 1,75gr Agarosa.
• 125 ml de Fashblue 0,75x
• 400microL Danablue 0,1%
• Balanza
• Microondas
• Cubeta y fuente de electroforesis
• Puntas de micropipeta

Muestras:

• Verde: 20 microL Fashgreen
• Negro: 90microL Marcador ECORI Y HIND III
• Lila: 90microL ADN LAMBDA y tampón de carga
• Amarillo: 50 microL agua
• Azul: 12 microL Hind III
• Rojo: 12 microL Ecori RI
• Blanco: 50 microL ADN LAMBDA

→ PROCEDIMIENTO.

1.- Preparación del gel de agarosa:
Antes de hacer el gel, montamos el molde con los topes y colocamos el peine de las muestras

Pesamos 0,4 gr aproximadamente de agarosa. En un vaso Erlenmeyer añadimos 42 ml de tampón de electroforesis y diluimos la agarosa. A continuación añadimos.

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