Diagnóstico molecular de la cepa Ralstonia solanacearum EAP009 mediante la técnica de PCR estándar

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Fundamentos en Biotecnología | Laboratorio #1

Diagnóstico molecular de la cepa Ralstonia solanacearum EAP009 mediante la técnica

de PCR estándar

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Daniela Serna Muriel – Isabella Gallego Rendón

Resumen

En este informe se muestran los resultados de la extracción y amplificación de la cepa Ralstonia solanacearum EAP009. El objetivo principal fue hacer un acercamiento a las técnicas de diagnostico molecular que se usan actualmente, en este caso, PCR aplicada a una cepa de Ralstonia solanacearum EAP009, la cual causa la enfermedad del moco. Para realizar la PCR se usaron los primers 759R/760F y para revelar el resultado se hizo una electroforesis en gel de agarosa a una concentración de 1.2% y posteriormente se llevó a un fotodocumentador. En la practica no se llevo a cabo la electroforesis, sin embargo, logramos analizar resultados obtenidos por la profesora.

1. Introducción

El diagnóstico molecular es de gran importancia para la salud humana, ya que incluye técnicas de biología molecular que ayudan a detectar y cuantificar proteínas, ADN y ARN de un tejido o liquido corporal. Actualmente esta área es está en constante desarrollo y se ha enfocado principalmente en diagnóstico de enfermedades infecciosas, lo que ha llevado al uso de técnicas moleculares para la detección del cáncer y enfermedades genéticas, por lo que es una de las áreas con mayor crecimiento en cuanto a sus estrategias para tratar distintas enfermedades por medio de técnicas que tienen un estándar alto de calidad (1). Lo anterior sugiere que las técnicas que sean usadas para este tipo de diagnóstico deben de ser rápidas, precisas, sencillas y asequibles, como por ejemplo la tinción de Gram y la detección de antígenos o detección génica, sin embargo, las principales características que debería de tener una técnica de diagnóstico son una alta especificidad y sensibilidad (2), y hoy en día con la optimización de estas técnicas de diagnóstico tradicional se ha logrado obtener técnicas de laboratorio con fundamento en biología molecular, como por ejemplo, la reacción de cadena de la polimerasa, hibridación de sondas de ADN, secuenciación de genomas, secuenciación paralela, pirosecuenciación, entre otras, que cumplen con el objetivo de dar un una detección y diagnóstico rápido dando resultados confiables (3).  

Dentro de todas las técnicas que ayudan a un diagnóstico molecular confiable y eficaz en la detección rápida de enfermedades, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ha sido la principal herramienta diagnostica, debido a su especificidad, rendimiento y fidelidad, gracias a los diferentes elementos que la componen (Ciclaje y ADN polimerasa) para que sea una mezcla en reacción y las cantidades mínimas de material genético que requiere para llevarse a cabo (4).  Esta técnica permite principalmente la amplificación especifica de un segmento de ADN, conocer las secuencias que lo flanquean y obtener una secuencia de ADN concreta sin hacer clonación (3). Su mecanismo de acción es a partir de la amplificación de un fragmento de ADN mediante ciclos, que se repiten un numero especifico de veces, compuestos por tres pasos principales, desnaturalización, alineación y extensión. El anterior proceso se lleva a cabo en un termociclador donde se alterar las temperaturas durante los periodos programados y se obtiene al final de todos los ciclos las regiones amplificadas, denominadas amplicones (4).

1. Materiales y métodos

1. Materiales

• Colonia de Ralstonia solanacearum EAP-009 activada en medio BGA
• Asa de aro
• Mechero
• Eppendorf estériles de 1.5 mL y 0.2 mL
• Agua estéril (100 mL)
• Bloque de calor o Thermo Mixer
• Centrífuga
• Micropipetas
• Puntas (micropipetas) de 1000 µL, 10 a 200 µL, 2 a 10 µL
• Reactivos para preparar Master Mix  (dados por el profesor)
• Cebadores específicos 759/760
• NanoDrop
• Termociclador
• Cámara de electroforesis
• Agarosa
• Buffer TBE 1X
• Fotodocumentador

1. Métodos [pic 5]

1. Resultados

Teniendo en cuenta los siguientes resultados de diagnóstico de Ralstonia solanacearum por PCR estándar, describa en la sección resultados lo que se pudo obtener en cada uno de los casos después de revelado el gel de agarosa y discuta (en la sección discusión) que pudo pasar si los resultados no fueron los esperados y como podría mejorarlos.

Caso 1: Muestra 1 (aislamiento del fitopatógeno de la planta #1), muestra 2 (aislamiento del fitopatógeno de la planta #2)[pic 6]

Caso 1: Se lograron obtener los aislados del fitopatógeno de ambas plantas.

Caso 2: M (marcador 1kb), 1-5 (muestras del fitopatógeno)[pic 7]

Caso 2: Se lograron obtener las muestras del fitopatógeno en los pozos 1, 2, 3 y 5. En el pozo 4 no se logra observar claramente la presencia del aislado.  

Caso 3: M (marcador 100pb), 1 (cotrol +), 2 (control -), 3-10 (muestras del fitopatógeno)

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Caso 3: Se lograron obtener todos los aislados del fitopatógeno.

1. Discusión

Como se puede observar en el caso 1 el procedimiento fue el acertado ya que se logró obtener los resultados esperados, sin embargo, las fluctuaciones en los tamaños de las muestras nos indican que el proceso pudo haber sido mas preciso para obtener consistencia en los resultados del gel. En la muestra #2 los resultados son más precisos ya que se mantiene el tamaño de las muestras en todos los casos con referencia al control. Para mejorar los resultados de la muestra #1 habría que verificar que todas las muestras se hayan tomado a la misma concentración, esto nos aseguraría resultados más consistentes para esta muestra.

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