ELECTROFORESIS HORIZONTAL EN GEL DE AGAROSA Físico química

ELECTROFORESIS HORIZONTAL EN GEL DE AGAROSA

MATERIALES:

• Guantes.
• Juego de micropipetas y puntas.
• Microondas.
• Cubeta de electroforesis.
• Fuente de alimentación.
• Captador de imágenes.
• Marcador de peso molecular.

REACTIVOS:

• Tampón TBE:

• 0.45 M Tris Base.
• 0.45 M Acido Bórico.
• 10nM EDTA.
• Ajustar a pH 8.

• Tampón de carga (6X):

• 40% sacarosa.
• 0.25% azul de bromofenol.
• 0.1 M EDTA.

• Agarosa.
• Bromuro de etidio 0.5 g/mL.

PASOS:

1. Se prepara el molde, la bandeja y el peine.
2. Se prepara la agarosa disolviéndola en 100 mL del tampón TBE, calentándola la mezcla en el microondas hasta casi la ebullición.
3. Verte la agarosa liquida en la bandeja y dejar enfriar y solidificar.
4. Mientras el gel se solidifica, se preparan las muestras con el juego de pipetas y puntas añadiéndole el tampón de carga para que así permanezca en el pocillo al aumentar la densidad de la muestra y también permitir ver el frente de avance gracias al colorante que contiene, determinando así el momento en que se puede detener la corriente.
5. Retirar el peine y pasar la bandeja con el gel a la cubeta de electroforesis, está cubeta tiene que estar lo suficiente llena de tampón TBE, para cubrir el gel.  

[pic 1]

1. Colocar las muestras en los pocillos, añadiendo también un marcador de peso molecular.
2. Cerrar la cubeta y conectar a la fuente de alimentación.
3. Programar el voltaje y comenzar la electroforesis. El voltaje depende del tamaño del gel, en este caso será de 90 volts.

[pic 2]

1. Retirar el gel y teñirlo con bromuro de etidio que emitirá fluorescencia al verlo en luz ultravioleta, este debe manipularse con guantes.  
2. Retirar el gel y ponerlo en el visualizador.
3. Los fragmentos obtenidos se observarán como bandas fluorescentes, de 100 a 1000 pares de bases, comparar los fragmentos con los obtenidos del marcador. [pic 3]

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