EXTRACIÓN DE ADN, ARN Y ADN PLASMIDICO, E IMPORTANCIA DE SUS TECNICAS MOLECULARES PARA LA INVESTIGACIÓN

EXTRACIÓN DE ADN, ARN Y ADN PLASMIDICO, E IMPORTANCIA DE SUS TECNICAS MOLECULARES PARA LA INVESTIGACIÓN

Chamorro-N., Ramírez-M.A., Rojas-M.A.

Universidad del Quindío
Facultad de Ciencias Básicas y Tecnologías
Programa de Biología

RESUMEN

Los marcadores moleculares son una herramienta muy robusta que nos permite estudiar y entender a la naturaleza desde diferentes perspectivas con enfoques novedosos y complementarios a los que se abordan con herramientas tradicionales. Estos marcadores se basan en el análisis de las diferencias en moléculas como proteínas, ARN y ADN.
La extracción y purificación de ADN representa la etapa inicial de casi todas las técnicas moleculares

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR, se expone el fundamento de la síntesis in vitro de fragmentos de ADN, se detallan aspectos que ayudan a optimizar las condiciones de la reacción en cada una de las etapas de la técnica como la concentración de ADN molde y el resto de los componentes

Posteriormente se revisa una de las técnicas principales y a la vez complementarias de la mayoría de marcadores, la electroforesis en gel. Ésta se ha convertido en la principal técnica para separar moléculas de ácidos nucleicos y proteínas

INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos son polímeros formados por bases orgánicas, azucares y ácido fosfórico, su peso molecular (PM) es muy variable. Son de función biológica en ellas reside la codificación, almacenamiento, transmisión y expresión individual de la información genética (Primo, 1995).
El ADN es la molécula que lleva la información genética utilizada por una célula para la creación de proteínas. Contiene las instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos. (Romero, 1993).

El más importante es el ADN que es el material genético, se encuentra en el núcleo formando parte de los cromosomas, también hay ADN en las mitocondrias y en los cloroplastos y algunas cadenas circulatorias muchas más pequeñas, llamadas plásmidos, completan la dotación genética de muchas células. (Primo, 1995)

Los plásmidos tienen gran importancia en la perpetuación de la resistencia en los microorganismos; son unidades replicativas de ADN, que han evolucionado durante la era antibiótica mediante la adquisición secuencial de genes de resistencia (Ausina & Moreno, 2005). Es indudable la importancia que posee esta propiedad en los experimentos de clonación, puesto que permite incrementar enormemente la cantidad de información genética exógena introducida en la célula (Sánchez & Guerrero 1982)

Otros ácidos nucleicos, los ARN tienen otras funciones biológicas, también muy importantes. (Primo, 1995)

La extracción de ADN no ofrece problemas si se extrae desde la sangre y existen muchos protocolos y variaciones de extracción de ADN (Romero, 1993).

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula (Lodish et al., 2005)

 La mayoría de protocolos para extracción de ARN están basados en el método descrito por Chomezynski y Sacchi, el cual se basa en el aislamiento de este ácido nucléico empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante el procedimiento debe realizarse una etapa de homogenización de la muestra con el reactivo que contenga la solución fenol-isotiocianato, donde este último se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras rompe las células y disuelve sus componentes, la adición posterior de cloroformo separa la solución en fase acuosa y orgánica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar por precipitación el ARN. La mayor dificultad en la extracción del ARN es evitar la contaminación con RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores para su función. Esta técnica permite obtener ARN a partir de pequeñas cantidades de tejido y células en cultivo o suspensión de origen humano, vegetal, animal o bacteriano. (Karp & Pérez, 1998).

En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especies para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN con o sin función conocida que proporcionan información sobre la variación alélica y permiten distinguir individuos (Schlötterer 2004). Estos marcadores se obtienen con técnicas como la PCR (por las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction) y secuenciación, que hacen posible analizar la variación en la molécula del ADN con un detalle sin precedentes (Schlöttlerer 2004; Hudson 2008). Los datos moleculares han permitido estudiar con mayor precisión los patrones de diversidad genética y su distribución; el comportamiento; la selección natural; las interacciones biológicas; la composición, funcionamiento y dinámica de comunidades microbianas; las relaciones filogenéticas, entre otros (Sunnucks 2000; Schlötterer 2004). La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN y la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la extracción de ADN íntegro y puro (Hudson 2008).

La electroforesis en gel de agarosa es un método muy utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. La agarosa es un polímero lineal, extraído de algas marinas, en el cual las moléculas de ADN de doble cadena, migran hacia los polos con cargas opuestas a las suyas. La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en una mezcla por aplicación de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga-masa. (Lodish et al., 2005)

Este método también permite determinar si la PCR fue exitosa, si el producto resultante es del tamaño correcto, si otros productos fueron amplificados así, y si la concentración del producto resultante es adecuada para el ciclo de secuenciación. Se ha observado que los fragmentos de ADN que van desde 50 pb a 20.000 pb se resuelven bien utilizando varias concentraciones de geles de agarosa (Roca & Rodríguez, 2003)

El principal objetivo de este trabajo es conocer los fundamentos e importancia de extracción de ADN y ARN a partir de sangre, con sus técnicas de estudio que permiten una evolución para la ciencia

DISCUSIÓN

Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite (Sambrook et al. 1989).

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