El alumno aprenderá a medir la actividad de una enzima comercial

OBJETIVO:

El alumno aprenderá a medir la actividad de una enzima comercial.

Fundamento

La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. Para poder estudiar a las enzimas y aplicarlas en procesos industriales es necesario conocer su cinética y el primer paso es determinar la cantidad de enzima necesaria para realizar la conversión de sustrato a producto, es decir, la actividad enzimática. En esta determinación se mide la concentración de sustrato transformado o producto sintetizado por unidad de tiempo bajo condiciones en las que la concentración de sustrato es muy cercana a la concentración en el inicio de la reacción. Los métodos más utilizados en los ensayos enzimáticos abarcan la espectrofotometría, electroforesis, decaimiento radioactivo, cromatografía, ensayos inmunológicos, entre otros. La actividad enzimática se expresa generalmente como unidades de actividad enzimática (U) definida como los micromoles de sustrato transformado o producto sintetizado en un minuto.

MATERIAL.

Almidón 2%

Buffer fosfatos pH 6, 100 mM

Solución de -amilasa 0.5 U/ml en buffer fosfatos

Ácido dinitrosalicílico (DNS), 300 mL

Estándar de glucosa 0.2%

Baño 60°C

Baños con hielo

Plancha de calentamiento

15 tubos de ensaye 18x150

Vaso de precipitados de vidrio de 1 o 2 L

Gradilla para tubos de ensayo

Metodología

Los estándares se preparan y posteriormente se toma 1 ml de ellos y se deposita en un tubo nuevo que contenga 3 ml de DNS.

Monta la reacción por duplicado (solo el tubo de reacción) e incuba a 60°C tanto el blanco como la reacción duplicada. Inicia el conteo del tiempo una vez que los tubos estén en el agua a 60ºC. Toma 1 mL de muestra cada 10 minutos por una hora. Para inactivar la reacción transfiere las muestras tomadas a otro tubo que contenga previamente 3 mL de DNS.

Una vez terminada la reacción, las muestras con el DNS se calentarán a ebullición por 5 min, asegurándote que el agua esté hirviendo antes de sumergir los tubos.

Enseguida los tubos se enfriarán en hielo por 5 min, se les agregará 1 mL de agua destilada y se medirá la densidad óptica a 540 nm. No olvides agitar los tubos antes de leer la absorbancia, una vez que ya tienen todos los reactivos.

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