Espectrofotometria

La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido. Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede estar en fase líquida, sólida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para formar una solución. Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que muestra la cantidad de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a una determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

1. NATURALEZA DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

La Radiación Electromagnética es una forma de Energía radiante que se propaga en forma de ondas.

En este fenómeno ondulatorio se define:

a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, según el S.I. en nanómetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m.

b) Frecuencia (n): es el número de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su fórmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o hertzios.

c) Fotones: la luz está formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotón depende de la frecuencia y de la longitud de onda, según la siguiente expresión: E = h x n = h x c/n (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energía Electromagnética se mide el Ergios. La relación entre la longitud de onda y la Energía es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energía y viceversa.

d) Espectro Electromagnético: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las más interesantes para nosotros son:

• Región Ultravioleta: l = 10-380 nm

• Región Visible: l = 380-780 nm

• Región Infrarroja: l = 780-30.000 nm

• En la Región Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molécula puede ser dispersada o absorbida.

2. FENÓMENOS DE INTERACCIÓN ENTRE LUZ Y MATERIA

A. FENÓMENO DE ABSORCIÓN

Cuando una partícula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partícula en estado excitado. La molécula absorbe la E de la onda y aumenta su energía, y ese aumento de energía es igual a la E de la Radiación Electromagnética absorbida (E = h.n). La partícula en estado excitado tiende a volver de forma espontánea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor.

“Espectro de Absorción”. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromógeno, tiene un determinado espectro de absorción. El espectro de absorción es un gráfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución es el fundamento de la espectrofotometría de absorción.

Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).

B. FENÓMENO DE EMISIÓN

Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisión de energía radiante. En este caso, lo que se mide es la energía emitida y, en este fenómeno se basa la “fotometría de llama” o la “fluorescencia”.

Se denomina Análisis Colorimétrico al conjunto de métodos de análisis cuantitativos que se fundamentan en la medición de la intensidad de la luz transmitida a través de una solución coloreada, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas ò que se han hecho de tal calidad mediante reacciones químicas adecuadas.

Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la radiación queda absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una reducción de su intensidad (Luz transmitida, I), proporcional a la capacidad de absorción de dichas moléculas.

Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en forma selectiva determinadas radiaciones luminosas unas más que otras dejándolas pasar. La longitud de onda en la que las moléculas de dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la luz, se denomina “longitud de máxima absorción” o “lambda máximo”.

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