ANALISIS SOBRE LA DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE ABSORCIÓN DE LAS PROTEÍNAS PURIFICADAS POR ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA Y CROMATOGRAFÍA CONVENCIONAL COMBINADO CON LA DETECCIÓN DE MÚLTIPLES LONGITUDES DE ONDA

ANALISIS SOBRE LA DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE ABSORCIÓN DE LAS PROTEÍNAS PURIFICADAS POR ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA Y CROMATOGRAFÍA CONVENCIONAL COMBINADO CON LA DETECCIÓN DE MÚLTIPLES LONGITUDES DE ONDA

En cuanto a la determinación directa, la espectrofotometría ultravioleta de los coeficientes de absorción de la proteína se encontró que era más reproducible y precisa al diluir fue sustituido por cromatografía y la detección de múltiples longitudes de onda. Existen cuatro diferentes métodos de espectrofotometría estos son: Espectroscópicos, moleculares, espectroscopia de emisión atómica, y espectroscopia de absorción atómica que se describe en la literatura, por lo tanto realizan una compararon mediante el cálculo A0.1 280% los valores de los espectros de 25 proteínas, obtenidos por cromatografía. Sólo dos métodos, es decir, uno basado en la absorbancia a 210 nm y el otro en la absorbancia a 205 nm, corregida por la absorción de los aminoácidos aromáticos a esa longitud de onda, eran lo suficientemente precisos para ser de utilidad potencial para la determinación de proteínas desconocidas. Se encontró, sin embargo, que con los valores A203 sin corregir aún mejores resultados pueden alcanzarse. Usando 7 proteínas bien definidas la ecuación A0.1% 280 = 38,69 A280/A203 X - 0.01 se estableció mediante regresión lineal. A0.1 280% los valores para 14 proteínas puras calculado con esta ecuación mostró una desviación media de sólo el 4% de los valores de la lectura. Desde desviaciones similares se observaron con 5 cromóforos y glicoproteínas 7, 3 y 7%, respectivamente, por tanto se determino que el método puede tener una aplicación universal. En la configuración utilizada, sólo 40 microgramos de una proteína son necesarios para la determinación cromatográfica de su coeficiente de absorción.

En los estudios realizados es constante que nos enfrentemos con el problema de la caracterización de un purificado, en este caso sobre una proteína desconocida por lo que se requiere una precisa determinación de su concentración; es así que se realizan varias purificaciones enzimáticas, pero al determinarlas se llega a la conclusión de que al terminar con el procedimiento nos encontramos con pequeñas cantidades de proteína, y con un simple método como la determinación del peso seco, por lo que, no siempre es factible o no es apropiado ya que cuenta con pérdida inherente de material activo; en cambio con el índice de refracción las determinaciones de la concentración las medidas son confiables, pero no es confiable si es aplicada a las proteínas con un grupo cromóforo o hidratos de carbono.

Generalmente el que es más rápido y fácil de realizar es el de ultravioleta directa

ya que estos determinaron las concentraciones de la absorbancia a 210nm, mientras otros utilizan los valores de absorbancia a 205 nm, corregida por la tirosina y contribuciones de triptófano a esa longitud de onda.

Se realizaron

ABSORCIÓN POR COEFICIENTES ESPECTROFOTOMETRÍA / CROMATOGRAFÍA 197

la diferencia en la absorbancia en 2 15 y 225

nm. Whittaker y Granum (11) hicieron uso de

la observación de que para una "proteína promedio"

las absorbancias excepto los de los enlaces peptídicos

son iguales a 235 y 280 nm. En teoría, la proteína

concentraciones se puede determinar más

precisión en longitudes de onda inferiores a 200 nm (6)

pero estas medidas son experimentalmente

más problemático, ya que imponen elevados

exigencias en la calidad de la instrumentación

y tampones.

Correcta aplicación de estos métodos requiere

una serie de diluciones adecuadas para ser medido,

pero lamentablemente los resultados muestran a menudo

reproducibilidad pobres (4,10,16), como se confirmó

en esta investigación. Por lo tanto, a la vista

de las posibilidades de detección por red de fotodiodos,

cabe preguntarse si más fiable

resultados pueden ser obtenidos por cromatografía

la proteína y tomando una serie de espectros

en el pico. En el presente trabajo los resultados de

dicha investigación se describen.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales. Albúmina sérica humana (11.860)

albúmina de suero bovino (11.920) un quimotripsina-

(Páncreas carne de vacuno, 17 160), yglobulin humanos

(22520) tiroglobulina (cerdo, 36488)

malato deshidrogenasa (las mitocondrias del corazón de cerdo,

28345), y lactoglobulina (leche de vaca,

27440) inhibidor de tripsina de soja (37.328)

DNasa I (páncreas bovino, 18.550) y la glucosa

oxidasa (Aspergillus niger, 22.738) fueron

de Serva (fuente, cat. número). Pepsina

(Mucosa del estómago de cerdo, P-6887), ovoalbúmina

(Huevo de gallina, A-7641) avidina (pollo

huevo, A-9390), mioglobina (corazón caballo, M-

1882) RNasa (páncreas bovino, R-4875), el citocromo

c (corazón caballo, C-7752), a-lactoalbúmina

(Leche de vaca, L-60 10) y (Y 1-glicoproteína ácida

(Humanos, G-9885) fueron de Sigma.

/ 3-glucuronidasa (hígado de bovino, 2353), aldolasa

(Músculo de conejo, A-5257) y hemocianina

(Limuluspolyphenus, 05.520) eran de Worthington.

El alcohol deshidrogenasa (hígado caballo,

15320) fue de Boehringer, a-amilasa (Bacillus

subtilis, 1329) y la lisozima de pollo (

huevo, 5282) fueron de Merck. Azurmendi (Pseudomonas

aeruginosa) fue una especie de regalo de la Dra.

G. W. Canter.

dilución en serie de muestras de la proteína. Concentrado

soluciones de proteínas (aproximadamente 10 mg

proteína / ml) se diluyeron secuencialmente doble

en 0,02 M tampón fosfato de sodio, pH 6,5.

factores de dilución se determina mediante pesada.

Espectrofotometría. Absorbancias de las

soluciones de proteínas se midieron con un Beckman

Espectrofotómetro UV 5260 y Hewlett-a-

Packard HP8450A arsenal del fotodiodo

espectrofotómetro.

Cromatografía y detección de matriz de fotodiodos.

De alto rendimiento de permeación en gel

cromatografía se realizó con Aguas

M6000 bomba en columnas Serva Si-300-poliol

con 0,1 M de tampón fosfato de sodio, pH 6.5,

como eluyente. El caudal fue de 0,2 ml / min

con un 4,5 X 250 mm de columna y 0,5 ml / min

con una columna de 9.1 x 500 mm. Las muestras que contienen

aproximadamente 40 pg de proteína (en menos

de 100 ~

...