MÉTODOS DE ANÁLISIS Determinación de proteínas por el método de Bradford y Lowry

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ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

UNIDAD STO. TOMÁS

Departamento de Bioquímica

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Determinación de proteínas por el método de Bradford y Lowry

• PROFESORA:

• MARTÍNEZ REYES CINTHYA SALIMAH

• ALUMNA:

FUNDAMENTO

El método de Bradford está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm). La formación del complejo colorante-proteína tarda 2 minutos y permanece estable por 1 hora, por lo que el procedimiento es rápido y el tiempo para realizar el ensayo no es una limitante. El complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción, lo que hace al ensayo aproximadamente cuatro veces más sensible que el ensayo de Lowry.[pic 3]

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El método de Lowry  es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo colorido con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A= abc. Este método consta de dos etapas:

1. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína presentan un color azul claro; además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína exponiendo así los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

1.  La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

OBJETIVO GENERAL

• Comparar dos métodos para determinación de proteínas (Bradford y Lowry) y establecer cuál es el de mayor precisión y exactitud.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

•  Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.
• Determinar el efecto de sustancias no proteínicas que puedan interferir en el método.
• Analizar ventajas y desventajas de ambos métodos.

RESULTADOS

Tabla 1. Resultados de las mediciones espectrofotométricas a diferentes absorbancias según el método de Bradford o Lowry.

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Figura 1. Curva tipo del método de Bradford a una absorbancia de 595nm

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 Figura 2. Curva tipo del método de Lowry a una absorbancia de 590nm

Tabla 2. Resultados de las réplicas para el análisis estadístico de los métodos de Bradford y Lowry.

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