Cuantificación De Proteina Soluble Por El método De Bradford

Cuantificación de proteína soluble

La cuantificación de proteína es realizada indirectamente por espectrofotometría a 595 nm mediante el método colorimétrico de Bradford (Bradford., 1976). Este método tiene como principio el cambio de color del colorante Coomassie brillant blue G-250, de rojo a azul a medida que se une a una proteína. Cabe mencionar que el complejo coloreado presenta una estabilidad de aproximadamente una hora, por lo que el proceso de medición debe realizarse antes de este tiempo desde el comienzo la reacción de acoplamiento.

Para la cuantificación de proteínas en una muestra se debe construir previamente una curva de calibrado mediante la medición de absorbancia de una serie de soluciones con concentraciones conocidas de una proteína estándar (Albúmina de suero bovina) sometidas a la tinción. Esta metodología tiene la ventaja de al ser rápida, sensible y reproducible.

Preparación de reactivos

Reactivo de Bradford

• Pesar 100 mg de colorante Coomasie brillant Blue G-250.

• Disolver dicha cantidad en 50 mL de etanol 95%.

• Agregar lentamente 100 mL de ácido fosfórico 85% p/v.

• Aforar a 1 L con agua destilada.

• Filtrar la solución y luego almacenarla a temperatura ambiente protegida de la luz.

Solución stock de 1 mg*ml-1 de albúmina de suero bovino (BSA)

• En un matraz de aforo disolver 250 mg de BSA en 250 mL de agua destilada.

• Alicuotar la solución en tubos Eppendorf utilizando volúmenes pequeños de aproximadamente 0,5 mL y almacenar en frio.

Construcción de la curva de calibrado

• Preparar en tubos de ensayo 0,1 mL de diferentes diluciones de la solución estándar de proteínas (BSA) diluidas apropiadamente con tampón fosfato 25 mM (pH 7,0). Las concentraciones de BSA utilizada para realizar la curva patrón deben encontrarse entre 0,01 y 0,1 mg*mL-1.

• Agregar 1 mL del reactivo de Bradford y homogenizar.

• Leer la absorbancia a 595 nm a cada una de las diluciones, previa calibración del espectrofotómetro con una solución de tampón fosfato 25 mM (pH 7,0) y reactivo de Bradford como blanco.

Procedimiento

• Adicionar 1 mL de reactivo de Bradford a 0,1 mL de una muestra de solución diluida adecuadamente con tampón fosfato 25 mM (pH 7,0).

• Homogenizar la mezcla suavemente y leer su absorbancia en espectrofotómetro a 595 nm después de 15 minutos y antes de 1 hora de reacción, contra un blanco de reactivo preparado con tampón fosfato 25 mM (pH 7,0).

• Determinar la concentración de la muestra utilizando la ecuación obtenida de la regresión lineal de la curva de calibrado previamente elaborada.

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