DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL METÓDO DE LOWRY

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Nombre: Viramontes Bocanegra Roberto Carlos

Grupo: 4IM1                                                          Sección 1 

Asignatura: Laboratorio de Métodos de Análisis

Profesor: Francisco C. Fernández  López

PRÁCTICA:

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL METÓDO DE LOWRY

CICLO ESCOLAR:

FEBRERO-JUNIO 2016

PRÁCTICA:

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY

1. Introducción

La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que más frecuentemente se utilizan, anteriormente se evaluaba la cantidad de proteínas midiendo la cantidad de nitrógeno proteico y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína, este era un método largo y laborioso  con poca sensibilidad, hoy día la aparición de métodos colorimétricos ha permitido solventar estos inconvenientes.

Entre los métodos colorimétricos destacan 3 muy importantes, los cuales son el método de Biuret, el método de Lowry y el método de Azul de Cromassie. El método de Lowry tiene la ventaja de ser sensible pero no lo suficiente a comparación de otros métodos, capaz de detectar cantidades del orden 10 µg de proteínas, su inconveniente principal es que al evaluar la cantidad de proteína la intensidad de color varía dependiendo la cantidad de tirosina triptófano o fenilalanina presentes en la muestra de proteína, haciendo a este método muy selectivo y además de que para poder determinar la cantidad de proteínas presentes en él se necesita un estándar de la misma proteína además que nos sirve para conocer cómo está el compuesto respecto a los aminoácidos que se pueden identificar con él.

2. FUNDAMENTO

El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra problema se le añade un reactivo que forma un complejo colorido con las proteínas siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, cumpliendo la ley de Bouguer-Beer en las absorbancias, fundamentándose la formación de color de este método en 2 reacciones complejas principales:

1. Los iones , en medio alcalino del reactivo de Biuret, se unen a la proteína formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos -proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos con grupos R aromáticos de tirosina, triptófano o fenilalanina que participarán en la segunda etapa de la reacción. El  se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo de coordinación con al menos 2 enlaces peptídicos.[pic 5][pic 6][pic 7]
2. La reducción, también en medio alcalino, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos aromáticos de los residuos de tirosina, triptófano y fenilalanina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal componente del reactivo de Folin es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos aromáticos da lugar a un complejo de color azul intenso que se lee en el espectrofotómetro a 590 nm. Como se dijo anteriormente la intensidad de color dependerá de  la cantidad de tirosina y triptófano contenidos en la proteína.

Dado que este método da resultados variables se requiere de una curva de calibración que se hace a partir de una proteína estándar (hemoglobina).

3. OBJETIVOS

1. Elaborar una curva de calibración para cuantificar proteínas empleando un método fotométrico.
2. Determinar si existe diferencia estadísticamente significativa en precisión y exactitud entre los métodos de Bradford y de Lowry.
3. Conocer el efecto de sustancias no proteínicas desarrollando el color de la reacción.
4. Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry con respecto a otros métodos para cuantificar proteínas.

4. RESULTADOS

Con toda la metodología seguida en la práctica, se llevó a cabo una curva de calibración con la reacción del método de Lowry, además de que se realizó un análisis estádistico e interferencias del método, con lo cual se presentan los resultados a continuación:

1. Curva de calibración de la hemoglobina por el método de Lowry

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Nota: El dato marcado en amarillo es el dato aberrante en nuestra gráfica, este dato se eliminó comparándolo con datos de otro equipo que trabajo con hemoglobina.

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2.- Análisis Estádistico

Se repitió el método de Lowry 10 veces con la misma cantidad de proteína, y con ayuda de la ecuación de la curva de calibración se obtuvieron interpolando las absorbancias las siguientes cantidades de proteína.[pic 10]

De igual forma se realizó el análisis estádistico (Ver anexo) en d0onde se obtuvieron los siguientes resultados:

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