Práctica determinación de proteínas por el método del BCA

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA PLAN 2002

CICLO ESCOLAR Septiembre 2020- Febrero 2021

Torres Sánchez Christian Eduardo

4IV01- Laboratorio de Métodos de Análisis

Determinación de proteínas por el Método del Ácido Bicinconínico

Profesor: Francisco Carmelo Fernández López

Fecha de entrega: 14/Octubre/2020.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)

OBJETIVOS:

1. Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.
2. Conocer el efecto de las sustancias no proteicas en el desarrollo de la reacción colorida.
3. Determinar si existen diferencias estadísticamente significativas en la precisión y exactitud entre el método Bradford y el del BCA.
4. Analizar ventajas y desventajas del método del BCA, respecto a otros métodos para cuantificar proteínas.

FUNDAMENTO:
Los métodos para determinar proteínas se basan en la propiedad de las mismas de absorben luz en la región UV del espectro electromagnético a una longitud de onda de 280 nm, esto atribuido al grupo fenólico de la Tyr (Y) y al grupo indólico del Trp (W).
El cálculo de la concentración de las soluciones de proteínas se basa en el modo en que la materia absorbe la luz aplicando la Ley de Bouguer – Beer (A = ε ·c ·l ), que nos dice que la Absorbancia es directamente proporcional a la concentración molar, al coef. , de extinción molar y a la longitud de la celda, e inversamente proporcional a la Transmitancia.

Por último dicho método se basa en la reacción de BCA y el ion Cu+, donde las proteínas reducen a los iones cúpricos (Cu+2) del reactivo BCA a iones cuprosos (Cu+) en medio básico.

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RESULTADOS Y GRÁFICAS:

I Curva de calibración de Hemoglobina.

Para calcular la concentración de cada tubo partimos de la concentración inicial de la disolución de hemoglobina (20µg/mL).
En el caso del tubo No. 1 tomamos una alícuota de 100µL de dicham disolución, el primer paso es convertir esta alícuota de 100 µL en mL, esto con una regla de 3, si 1mL 🡪 1000µL entones cuánto es  100 µL?, esto es = 0.1mL.
Posteriormente con otra regla de 3, para conocer cuántos µg de hemoglobina va a haber en 0.1 mL, si en 1 mL hay 20µg.
20µg 🡪 1mL
x       🡪 0.1 mL
x= 2 µg/mL
posteriormente usamos este mismo procedimiento para los demás tubos a diferentes alícuotas.

[pic 4]

a)y=0.0311x – 0.0003 y R2=0.98

donde:
y=Absorbancia ; x=Concentración en μg/mL

b) Sí cumple la Ley de Bouguer y Beer ya que nos demuestra que la Absorbancia y la concentración del analito guardan una relación directamente proporcional

c) x= y + 0.0003/ 0.0311

II Análisis estadístico de Hemoglobina

Cálculos:
[  ] = A + 0.0003/ 0.0311
[ ] = (0.214)+0.0003/0.0311=6.8907,                 [ ] = (0.215)+0.0003/0.0311=6.9228, [ ] = (0.211)+0.0003/0.0311=6.7942,                 [ ] = (0.212)+0.0003/0.0311=6.8264, [ ] = (0.199)+0.0003/0.0311=6.4084,                 [ ] = (0.212)+0.0003/0.0311=6.8264, [ ] = (0.238)+0.0003/0.0311=7.6624,                 [ ] = (0.216)+0.0003/0.0311=6.955 , [ ] = (0.201)+0.0003/0.0311=6.4727,                 [ ] = (0.213)+0.0003/0.0311=6.8585.

TABLA RÉPLICAS PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Resultados para el análisis estadístico
Cálculos:

X=∑ni=1  Xi / n=6.86175

[pic 5]= 3.3636 x10-1
%C.v.= SD/X(100)
%C.V= 3.3636 x10-1/6.86175 (100)=4.902
I.C de µ= X ±  tSD/ n1/2    donde  t=2.262 95%
I.C de µ= 6.86175± [(2.262)( 3.3636 x10-1)] / [10]1/2 = (6.6211 – 7.1024)
Ea= X – Ve= Ea= 6.86175 - 6 = 0.86175
%Er= Ea/Ve(100)
%Er= 0.86175/6 (100)= 14.36%
%Exact= 100 - %Er
%Exact= 100 - 14.36%= 85.64%
%Precisión= 100 - %CV
%Precisión= 100 - 4.902%= 95.1 % 

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