DETERMINACION DE PROTEINAS POR METODO DE LOWRY Y BRADFORD

INTRODUCCIÓN

La determinación de proteínas por el método de Lowry se basa en el desarrollo de color, mediante una reacción que se efectúa en dos etapas. La primera consiste en la formación de un complejo colorido entre, al menos. 4 enlaces peptídicos de la proteína y el cobre cúprico en medio alcalino (reacción del biuret). La segunda, es la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico) por el complejo cobre-proteína, dando finalmente un color azul, de intensidad proporcional a la concentración de proteína, que se lee a 590 nm. La totalidad del color producido depende del contenido de tirosina y triptófano en la proteína.

El método de Bradford para la determinación de proteínas implica la reacción del Azul Brillante de Coomassie G-250 con las proteínas, originando un complejo colorido que se lee a 595 nm. Esta reacción es independiente de la composición de aminoácidos de las proteínas. El enlace entre el colorante y la proteína es muy rápido, aproximadamente 2 minutos a temperatura ambiente. El color desarrollado es estable por 1 hora.

OBJETIVOS

El alumno:

a) Elaborará una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.

b) Determinará si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.

c) Conocerá el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color. d) Analizará las ventajas y desventajas del método de Lowry, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME.

Tabla 3. Curva de calibración de albumina. Método de Lowry.

[pic 1]

1. Calcule y escriba los valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de correlación.

m = 0.0022            ordenada al origen= 0.0076            R² = 0.984

1. A partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma, obtenga la expresión matemática para calcular la cantidad de proteína.

[pic 2]

ANALISIS ESTADISTICO.

Calcule la media o promedio (x), la desviación estándar (s), la varianza (s2), el coeficiente de variación (CV) y los límites de confianza media (µ), con una confiabilidad del 95%.

Tabla 4. Réplicas para el análisis estadístico.

Tabla 5. Réplicas para el análisis estadístico.

EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEINICAS EN EL METODO DE LOWRY.

Tabla 6. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Lowry.

Interprete sus resultados y explique la posible causa de interferencia.

Podemos observar a través de la medición de la absorbancia distintos tipos de interferencia, causados por la transmitancia del aparato, al hacer pasar el haz de luz a través de la muestra, las diferentes sustancias absorben diferentes longitudes de onda lo que causa que nuestra absorbancia se vea afectada y por tanto a la hora de efectuar el cálculo de la cantidad de proteína igual manera, también se ve afectado por la estructura del fenol y detergente ya que el método de Lowry depende del contenido de tirosina y triptófano en la proteína.

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