Determinacion De Proteinas Por El Metodo De Bradford

TABLA 1. CURVA DE CALIBRACIÓN DE ALBÚMINA

Tubo Proteína (µg) Absorbancia (590)

1 25 0.232

1' 25 0.311

2 50 0.428

2' 50 0.41

3 75 0.499

3' 75 0.542

4 100 0.551

4' 100 0.579

5 125 0.572

5' 125 0.578

Grafica 1. Curva de calibración de albumina.

Si cumple la ley de Bouger-Beer, entre los 25µg y 100µg

Tabla 2. Análisis estadístico

Tubo Absorbancia (590nm) Cantidad de Proteína (µg)

1 0.532 96

2 0.516 90.66

3 0.544 100

4 0.54 98.66

5 0.539 98.33

6 0.576 110.66

7 0.476 77.33

8 0.49 82.00

9 0.52 92.00

10 0.53 95.33

Media 94.09

Desviación estandar 9.408

varianza 88.52

%C.V 9.99

Precisión 90.00

Error relativo 25.453

Exactitud 74.546

Limites de confianza (87.36,100.81)

TABLA 3. EFECTO DE INTERFERENCIA DE SUSTANCIAS NO PROTEICAS

Tubo Sustancia Absorbancia (590nm) Cantidad de Proteína (µg) Tipo de Interferencia Generada

1 Tris 1M pH 7 0.532 95.9 INTERFERENCIA +

2 Glicerol 0.55 101.9 INTERFERENCIA +

3 Detergente comercial 0.16 - 28.1 INTERFERENCIA -

4 SDS 0.134 - 36.76 INTERFERENCIA -

5 TCA 0.523 92.9 INTERFERENCIA +

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD

OBJETIVOS

• Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico

• Determinar precisión y exactitud del método

• Determinar efecto de algunas sustancias no proteínicas, que pueden interferir en el método

• Determinar si hay diferencia significativa con Lowry

• Analizar ventajas y desventajas de este método

INTRODUCCIÓN

El método involucra la unión de un colorante, el Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) a las proteínas. La solución del colorante libre es de color rojizo (máxima absorción a 465 nm) y cambia al azul (máxima absorción a 595 nm). La unión es un proceso rápido (aproximadamente 2 minutos) y el complejo colorante-proteína se mantiene estable hasta una hora después de producido.

Como en esta reacción el CBB se une específicamente a las proteínas, es un buen método de caracterización (aunque no de identificación). La reacción se prefiere a otras por su sensibilidad (mayor que la del Biuret), lo que significa que, para una misma muestra, puede obtenerse un resultado positivo con el reactivo de Bradford pero negativo con el reactivo del Biuret.

DIAGRAMA DE FLUJO

2. Análisis estadístico

Preparar 10 tubos con la misma cantidad de reactivos que en el tubo 3

3. Interferencias

Preparar 5 tubos con la misma cantidad d proteína que en el tubo 3 + 0.1mL de interferencia+2.6mL agua+3mL de reactivo de Bradford

COMPARACION DE MÉTODO DE LOWRY Y BRADFORD

VENTAJAS DESVENTAJAS

MÉTODO DE LOWRY  Muy sensible

 Menos afectado por la turbidez de la muestra

 Más específico que la mayoría de los otros métodos

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