Determinación de proteínas en arveja

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN ARVEJA Pisium sativum L.

Análisis cualitativo por método Biuret, criterio de solubilidad y espectrofotometría

Resumen

La arveja perteneciente a la familia de las leguminosas, es una buena fuente de proteínas de más fácil digestión para el organismo que las de origen animal. Por estas características se tomo como modelo para un análisis químico cualitativo de las distintas tipos de proteínas, para esto se usaron métodos como centrifugación para poder separarlas y proceder a realizar espectrofotometría, reacción de Biuret para su respectivo estudio.

Palabras claves: proteínas, espectrofotometría, método Biuret, solubilidad.

Introducción

La complejidad y la diversidad son características predominantes de las proteínas, por lo tanto, resulta difícil establecer una clasificación rigurosa; sin embargo, los diversos métodos para clasificarlas se basan en cuatro criterios fundamentales: composición, forma, solubilidad y función biológica. La clasificación más utilizada para fines prácticos es de acuerdo a su solubilidad, siendo el método de Osborne, el más conocido y que reporta cuatro tipos de proteína (Ibáñez, 1991).

a) Albúminas, solubles en agua y en soluciones salinas diluidas; precipitan en soluciones de sulfato de amonio a una concentración cercana a la saturación.

b) Globulinas, generalmente insolubles en agua pero solubles en soluciones salinas diluidas, ejemplo de éstas es la miosina (Gueguen y Cerletti, 1994).

c) Prolaminas, estas proteínas son solubles en etanol 50-80%. Constituyen un grupo cuyo nombre se originó por el alto contenido de prolina y nitrógeno amídico proveniente de la glutamina, que es el aminoácido presente en altas cantidades y que juntos en algunos casos llegan a ser hasta el 50% del nitrógeno del grano (Segura-nieto y Jiménez Flores, 1999).

d) Glutelinas, que se caracterizan por ser solubles en medio ácido o alcalino, como es la oricenina del arroz. Las glutelinas cuyo representante más conocido son las gluteninas aisladas del trigo (Huang y Khan, 1997).

La reacción Biuret es una medida del numero de enlaces peptídicos, dan un color rosado o lila que se debe al complejo de coordinación que se forma entre el átomo de cobre y cuatro átomos de nitrógeno provenientes del enlace peptídico. Esta compuesto de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4); el reactivo de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas y a rosado cuando se combinan con polipétidos de cadena corta. Para su respectiva reacción se somete a baño María en un tiempo prudente

La ley de Lambert Beer establece que la absorbancia esta directamente relacionada con las propiedades intrínsecas de la muestra, con su concentración y la longitud de la trayectoria de haz de radiación al atravesar la muestra

Materiales y Métodos

Esta investigación se llevo acabo en la ciudad de Manizales – Caldas, (2160 msnm), en el laboratorio de Bioquímica de la Universidad de Caldas donde se realizo cuatro extracciones consecutivas del macerado de arveja germinada. La germinación se realizo en un ambiente natural durante doce días con semillas obtenidas en un cultivo del jardín botánico de la universidad.

El macerado se lo hizo con 3.053 gr de muestra vegetal y 20 ml de agua destilada puesto que las Albuminas son solubles en agua; para separa estas proteínas se utiliza la densidad de las sustancias que se encuentran en el macerado y se procede a centrifugar la muestra durante 5 minutos a 2500 rpm obteniendo así un sobrenadante que serian las albuminas disueltas en agua destilada y un residuo que contiene otras proteínas y diverso material vegetal no solubles en agua.

El sobrenadante obtenido se le realiza la prueba cualitativa de Biuret agregando 4 ml del reactivo y sometiéndolo a baño Maria a 37°C durante 5 min con el objeto de determinar la presencia o ausencia en este caso de albumina. Luego se diluye esta muestra con agua destilada para llevarla al espectrofotómetro y datar su absorbancia a 550nm tomando como solución patrón agua destilada.

Siguiendo con la separación de las proteínas se toma el residuo que quedo de la anterior muestra y se le agrego NaCl 1% para la determinación de Globulina ya que esta es soluble en soluciones salinas, nuevamente se llevo a la centrifuga durante 5 min y 2500 rpm y se obtuvo un sobrenadante que seria las Globulinas y un precipitado que contiene otros compuestos vegetales.

Este sobrenadante se le realizo la prueba cualitativa de Biuret agregándole 4 ml del reactivo y sometiéndolo a baño Maria a 37°C durante 5 min para determinar la presencia de Globulina; seguidamente la muestra es diluida con NaCl 1% y se llevo al espectrofotómetro para datar su absorbancia a 550nm tomando como solución patrón NaCl 1%.

Luego tomamos el precipitado de la solución anterior y le agregamos etanol 75% para determinar la Prolamina ya que esta es soluble en soluciones acuosas de alcoholes de bajo peso molecular , se llevo a centrifugación durante 5 min y 2500 rpm y obtuvimos un sobrenadante que seria la prolamina y un precipitado que contiene otros compuestos vegetales; este sobrenadante se le realiza la prueba de Biuret agregándole 4ml del reactivo y se somete a baño Maria en las mismas condiciones anteriores para la determinación de prolaminas, esta muestra se la llevo al espectrofotometría previamente diluida con etanol a 550nm tomando una solución patrón de etanol.

Por ultimo sobre el residuo de la anterior muestra se le adiciono una solución de NaOH para determinar Glutelinas ya que esta proteína se solubiliza en soluciones diluidas de ácidos o bases, se llevo a centrifugación durante 5min y 2500rpm y se obtuvo un sobrenadante que corresponde a Glutelinas y un precipitado menos consistente, se le realizo la prueba de Biuret al sobrenadante agregando 4ml de este reactivo y sometiéndolo a baño Maria por 5 min a 37°C para determinar la presencia de proteína; luego diluimos esta muestra con NaOH para llevarla a espectrofotometría a 550nm tomando una solución patrón de NaOH y poder datar los resultados

Proteínas con prueba de Biuret

RESULTADOS Y DISCUSIONES

De acuerdo con los resultados cualitativos mediante prueba de Biuret obtuvimos resultados positivos para las muestras de Globulinas, Albuminas y Prolaminas; en cuanto a las Glutelina no hubo una reacción evidente que nos confirmara la presencia de proteína en esta muestra, como se muestra en la anterior imagen

Con respecto al análisis por espectrofotometría de las muestras se obtuvieron los siguientes datos

PROTEINAS ABSORBANCIA

Albuminas 0,603

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