Determinacion Cuantitativa De Las Proteinas.
Enviado por Diegolas • 20 de Abril de 2015 • 913 Palabras (4 Páginas) • 641 Visitas
Introducción
La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes. Entre los métodos calorimétricos destacan tres: el método de Biuret, el método de Lowry y el método de Azul de Coomasie.
El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A= .l.c.
Objetivo
Metodología
Este método consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+ -proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.
2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.
Reacción entre la proteína y los reactivos
Se rotularon los tubos de ensayo de 16 x 150 mm del 0 al 10; se procedió agregando los diferentes reactivos y agitando, acuerdo al cuadro siguiente:
TUBO
SOL. ESTANDAR BSA (albumina)
0.2mg/ml
(ml)
AGUA
(ml)
REACTIVO DE LOWRY
(ml)
REACTIVO DE FOLLIN
(ml)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
250
225
200
175
150
125
100
75
50
25
0
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
AGITAR y DEJAR REPOSAR 10´
125
125
125
125
125
125
125
125
125
125
125
REPOSAR 30´
LEER ABSORBANCIA l = 660nm
Con ayuda de las Pipeta automática/punta de 100, 500ml. al finalizar la rotulación se colocó en cada tubo de ensayo en la gradilla. Posteriormente se calibro el espectrómetro a absorbancia 0. A continuación con ayuda del aparato y celdas, se midió la absorbancia de cada una de las sustancia en cada tubo
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