Estabilización de Proteínas para Almacenamiento

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Estabilización de Proteínas para Almacenamiento

INTRODUCCIÓN

Después del aislamiento y la purificación, a menudo es necesario almacenar proteínas y péptidos durante largos períodos de tiempo antes de realizar proteómica biofísica, enzimática y estructural detallada. Por lo tanto, es esencial que la proteína diana pura mantenga su comportamiento biológico (o funcional) original durante un período prolongado de almacenamiento que puede oscilar entre semanas y años. Los productos farmacéuticos proteicos deben permanecer viables después de un envío y almacenamiento extensos, y deben permanecer desprovistos de todos los posibles procesos de inactivación. La vida útil de una proteína depende tanto de la naturaleza intrínseca de la proteína como de las condiciones de almacenamiento. Las proteínas (especialmente las enzimas) deben almacenarse a una temperatura y un rango de pH adecuados y, con frecuencia, en presencia de glicerol concentrado (~1 M), sacarosa o una sustancia similar. para que las proteínas retengan la actividad y eviten la agregación. Este artículo analiza las principales causas de la inactivación de proteínas y describe una serie de medidas que se pueden adoptar para mantener la estabilidad y la solubilidad de las proteínas.

INFORMACIÓN RELACIONADA

En este artículo se analizan varios métodos de purificación de proteínas en relación con la estabilidad de las proteínas. Parapara obtener más información acerca de la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, consulte Optimización de las concentraciones de imidazol para cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (Haneskog 2006a) y Purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados bajo concentraciones optimizadas de imidazol (Haneskog 2006b). El uso de resinas de afinidad se describe en Cromatografía de afinidad de lectina-agarosa (Brocklehurst et al. 2006a) y Cromatografía de afinidad de proteína ligando (Brocklehurst et al. 2006b). Las resinas de intercambio iónico se analizan en Preparación de una columna de intercambio iónico (Westerlund 2006a) y Separación de proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico (Westerlund 2006b). Los detalles de la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase reversa (RP-HPLC) se pueden encontrar en Condiciones cromatográficas estándar para RP-HPLC de proteínas (Carr y Moritz 2006). Para obtener detalles sobre la caracterización de preparaciones de proteínas purificadas mediante SDS-PAGE analítica, consulte SDS-PAGE of Proteins (Simpson 2006). La Figura 1 ilustra la pérdida de proteína con el tiempo de almacenamiento.

MUCHOS FACTORES CAUSAN LA INACTIVACIÓN DE PROTEÍNAS DURANTE LA PURIFICACIÓN Y EL ALMACENAMIENTO

Se puede demostrar que casi todas las propiedades de una proteína, excepto su secuencia primaria de aminoácidos, varíancon el pH, la temperatura y la concentración de iones del disolvente. Cuando se eliminan de su entorno celular natural, las proteínas están sujetas a una variedad de factores externos que pueden conducir a una pérdida (o deterioro) de su actividad biológica como resultado de alteraciones estructurales tanto covalentes como no covalentes. Los factores que pueden afectar la actividad biológica de una proteína incluyen los siguientes:

• Alteraciones en las condiciones de la solución (p. ej., dilución, temperatura y pH)
• Pérdida de un cofactor esencial
• Exposición a proteasas, oxígeno o metales pesados
• Cambios en las condiciones físicas como congelamiento y descongelamiento

Adaptado de Purifying Proteins for Proteomics (ed. Simpson). CSHLPrensa, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU., 2004.

Citar como: Frío Primavera Harb protocolo; 2010;doi:10.1101/pdb.top79        www.cshprotocols.org

FIGURA 1.Proteína pérdidas durante almacenamiento. liofilizado proteína normas eran disuelto en H2O y almacenado en polipropileno tubos en 4°C. En varios tiempo periodos, a pequeño parte de cada[pic 5]

muestra (4 μL) era retirado a estimar el proteína contenido.

cuantificación era basado en cima área siguiente RP-HPLC en a micro-fase invertida columna usando a trifluoroacético ácido/ace- tonitrilo elución sistema. Proteínas: (mEGF) murino epidérmico crecimiento factor (EGF); (rhEGF) recombinante humano FEAG; (a.lact) α- lactoalbúmina. Proteína pérdidas durante almacenamiento eran eludido por inclusión de 0,02% (v/v) (final concentración) interpolación 20 en el muestra. Datos eran amable proporcionó por CE Lindo (ludwig Instituto, Melbourne).

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