Estrés oxidativo.

METODOLOGÍA

Animales

Para la realización de este trabajo de investigación se utilizaron 90 ratas machos de       seis semanas de edad de la especie Rattus norvegicus (cepa Sprague–Dawley), las cuales fueron proporcionadas por el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). Éstas se mantuvieron por una semana en condiciones de laboratorio, para que se adaptaran al entorno.

Inducción de la diabetes

Después del período de aclimatación y con siete semanas de edad, se les administró a 54  animales, mediante inyección intraperitoneal, una dosis de aloxan de 100 mg.kg-1 de peso corporal (60 mg.ml-1 en buffer citrato-fosfato 0,1 mol.l-1, pH 4,5), para inducir la diabetes. El  aloxan es un componente tóxico selectivo de las células beta pancreáticas que las destruye,  induciendo un estado diabético insulinodependiente  (Miranda et al., 2004; Elsner et al., 2006). De acuerdo a Öztürk et al. (1996) la dosis utilizada en esta investigación los animales desarrollan  la mayoría de las complicaciones asociadas a la diabetes como son las cardiomiopatías, las neuropatías, las disfunciones arteriales coronarias, las alteraciones hepáticas y renales, entre otras.

Determinación de los niveles de glucosa

Las ratas controles también, se inyectaron con la misma cantidad de la solución buffer. La verificación de la enfermedad se hizo mediante la observación de los síntomas característicos como lo son: poliuria, polidipsia y polifagia, y por la medición de los niveles de glucosa en sangre a las 48 h después de la inducción, usando un glucómetro Prestige IQ; la muestra sanguínea se obtuvo por una punción en la cola utilizando lancetas. Se consideraron diabéticas las ratas cuyos niveles de glicemia eran  iguales o superiores a 200 mg.dl-1 (Murillo et al., 2006).

Diseño experimental

La distribución de las ratas para la experimentación se hizo  de la siguiente manera: se formaron 5 grupos, cada uno conformado por 6 ratas, identificados como: control normal agua (NA), control normal extracto (NE), diabéticas agua (DA diabéticas extracto  (DE) y  diabéticas insulina (DI) (Tabla 1). Cada día se verificó el consumo de alimento y líquido, por un periodo de dos meses, cuyo tiempo estuvo dividido en subperiodos de 15, 45 y 60 días,  para garantizar que los cambios metabólicos en los organismos estudiados fuesen significativos en cuanto a daños citopáticos y bioquímicos en el tejido renal. El control del efecto hipoglicemiante del extracto se estudió en un grupo experimental diabético, el cual fue tratado con insulina HumulinR (60/30), de acción prolongada, y se aplicó interdiariamente, en dosis de 2 unidades/kg de peso corporal de las ratas. Confirmada la hiperglicemia, se procedió a la administración del extracto acuoso de Phyllanthus niruri, colocando los animales en jaulas de acero inoxidable, con acceso libre a una dieta, que consistió en ratarina y agua en todo momento. Las ratas se mantuvieron  en condiciones estándar de laboratorio, a 25 ± 2°C, y condiciones normales de iluminación (12 horas de luz/12 horas de oscuridad) (Singh et al., 2007).

Tabla 1. Representación del diseño experimental de evaluación del efecto del extracto acuoso de Phyllanthus niruri, sobre el tejido renal de ratas con diabetes y controles durante dos meses en los tiempos 15, 45 y 60  días.

n= número de organismos

El extracto acuoso de P. niruri se suministró a una dosis de 200 mg.kg-1 de peso corporal, diluidos en el agua de consumo diario, durante un período de 60 días; el empleo de esta dosis, según algunos investigadores, presenta gran actividad hipoglicemiante (Hnatyszyn et al., 2002; Mazunder et al., 2005).

Material vegetal

La recolección de las plantas de la especie P. niruri perteneciente a la familia Euphorbiaceae, para la elaboración del extracto acuoso, se llevó a cabo en el periodo comprendido  desde febrero hasta abril de 2007, en los alrededores de la ciudad de Cumaná. Además, se tomaron  en cuenta  épocas vegetativas y reproductivas diferentes, con el objeto de evitar variaciones estacionales, fenológicas y ecológicas, controlando que no tuviesen la presencia de agentes infectantes como bacterias, hongos, insectos o parásitos. La correcta identificación taxonómica de las plantas recolectadas se realizó por comparación directa con  ejemplares almacenados en el Herbario “Isidro Ramón Bermúdez Romero” (HIRBR), Núcleo de Sucre de la Universidad de Oriente.

Con el fin de evitar que se presentaran cambios químicos en la planta, el material vegetal recolectado se desecó al aire libre, pero a la sombra. Seguidamente, se trasladó a un lugar igualmente sombreado y bien ventilado, evitando la superposición. Se removió constantemente, para no permitir  fermentaciones enzimáticas que alteraran la química de los ejemplares a estudiar y luego con la ayuda de un  molino eléctrico, se procedió a pulverizar las muestras de plantas para obtener el extracto crudo.

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