Evaluación de distintos rasgos virulentos de Klebsiella pneumoniae utilizando la ameba

Seminario n°3

Evaluación de distintos rasgos virulentos de Klebsiella pneumoniae utilizando la ameba

Dictyostelium discoideum y larvas de pez cebra (Danio rerio) como modelos de hospedero.[pic 1]

Abstracto:

• Las cepas de K. pneumoniae hipervirulentas y de resistencia múltiple son un gran peligro patogénico. Esta especie muestra una alta plasticidad genómica y varios elementos genéticos móviles asociados a cepas virulentas, desconociéndose las proteínas que codifican y su rol infectivo.
• Existen diversas limitaciones que afectan al uso de modelos de hospederos tradicionales (cerdos, ratones) para el estudio de la virulencia en K. pneumoniae, lo que hace necesario el uso de hospederos alternativos rentables y simples.
• Se estudia la virulencia de 3 cepas de K. pneumoniae (RYC492, 700603 y BAA-1705) en Dictyostelium discoideum (ameba social fagocítica) y Danio rerio (pez cebra). Se evalúa la resistencia a fagocitosis, la supervivencia intracelular, la letalidad, la colonización intestinal y el reclutamiento de células de la inmunidad innata. Ambos modelos permiten observar in vivo el proceso infectivo gracias a su transparencia óptica, pudiendo seguirse así las interacciones patógeno-hospedero en células vivas.

• Sólo RYC492 es virulenta en ambos hospederos (con una fuerte respuesta inmune asociada, alta resistencia a fagocitosis en la ameba, mayor capacidad de formación de biopelícula y una cápsula más prominente e irregular) y no las otras cepas multirresistentes. La cepa 700603 es capaz de replicarse al interior de las células de la ameba. El genoma de RYC492 cuenta con un número mayor de factores de virulencia. Tanto en esta como en 700603 no se pudo vincular un gen a la resistencia a fagocitosis como la supervivencia intracelular.

• Estos resultados muestras que ambos modelos de hospedero son ventajosos para el estudio de la virulencia de K. pneumoniae.

Introducción:

• La aparición de cepas multirresistentes y fenotipos hipervirulentos, el desarrollo tardío de métodos alternativos de control infectivo y de antibióticos han aumentado la preocupación sanitaria por los patógenos bacterianos. El bacilo gramnegativo K. pneumoniae es una de las causas principales de infecciones multirresistentes adquiridas en hospitales. Es un patógeno oportunista que causa infecciones adquiridas en hospitales, pero hay un número creciente de casos de infecciones invasivas graves adquiridas por comunidades humanas.
• Varios factores se asocian a la patogénesis de K. pneumoniae, y producen una mayor infectividad, superación de las defensas del huésped y resistencia a quimioterapia antimicrobiana:

o El antígeno O en LPS otorga resistencia a suero. Los sideróforos eliminan el hierro en entornos pobres en hierro. Las fimbrias de tipo I y III se asocian a la formación de biopelículas y a la colonización tisular. Una gran variedad de β-lactamasas y carbapenemasas de espectro amplio otorgan resistencia a β-lactámicos y carbapenémicos.

• El antígeno K (cápsula) confiere resistencia a péptidos antimicrobianos, la neutralización de anticuerpos específicos al antígeno K por unión a estos, la resistencia a la fagocitosis por neutrófilos y macrófagos, la formación de biopelículas, el establecimiento de la infección, la activación de la respuesta inmune y la facilitación de la colonización intestinal.
• Las cepas sin cápsula son menos virulentas que cepas isogénicas encapsuladas, y las cepas hipervirulentas cuentan con un fenotipo hipermucoviscoso, produciendo una cápsula más gruesa con exopolisacáridos mucoviscosos. Las cápsulas K1 y K2 se asocian a cepas hipervirulentas y a una mayor resistencia a la fagocitosis y muerte intracelular de macrófagos y neutrófilos, y pueden sobrevivir intracelularmente en una vacuola, evitar la entrega al lisosoma e inducir la apoptosis. Faltan estudios para corroborar las observaciones e identificar los determinantes detrás de la supervivencia intracelular, y para entender la base molecular del fenotipo hipervirulento.
• Se usan mamíferos como modelos de hospedero para el estudio de la virulencia de K. pneumoniae, pero el uso de estos está limitado por restricciones éticas y prácticas, necesitar de instalaciones costosas para el mantenimiento y manipulación, las restringidas limitaciones de análisis en tiempo real y por la necesidad de adquisición de muestras invasivas. Por ello, se han empezado a utilizar distintos modelos alternativos para estudiar la patogenia en distintas especies bacterianas, la detección y prueba de antimicrobianos y la antivirulencia.
• Cada modelo alternativo cuenta con ventajas y limitaciones. El estudio de las interacciones de un patógeno con cada modelo proporciona puntos de vista complementarios de la virulencia en contextos distintos de infección y ambientes. En la polilla G. mellonella se pudieron caracterizar factores de virulencia en K. pneumoniae como los determinantes del lípido A y de la cápsula, y las interacciones con el sistema inmune, y se usa para evaluar la eficacia de agentes antimicrobianos con cepas productoras de carbepenemasas. En C. elegans también se han estudiado otros factores de virulencia, como bombas de eflujo y proteínas de membrana externa, la patogénesis y la resistencia ante antimicrobianos. Este estudio aprovecha las ventajas de D. discoideum y D. rerio como hospederos para estudiar la patogénesis en K. pneumoniae.
• D. discoideum es una ameba bacteriófaga fagocítica, por lo que puede ser un huésped para bacterias oportunistas, y por ello cuenta con estrategias que evitan la invasión por patógenos y contrarrestar su supervivencia y replicación intracelular. Puede infectarse con patógenos bacterianos, y los factores de virulencia con roles importantes en mamíferos también importan en la interacción con la ameba. Tiene un crecimiento y mantenimiento fácil en laboratorio. Por esto se usa como modelo para estudiar la virulencia y la respuesta del hospedero con distintas especies bacterianas. También permite identificar factores del huésped para la detección y destrucción intracelular de K. pneumoniae por parte de células fagocíticas, y el papel de las estructuras superficiales de K.pneumoniae en su interacción con los fagocitos, e identificar factores asociados a la resistencia a la fagocitosis en cepas hipervirulentas, lo que respalda la relevancia de nuevos ensayos para las interacciones entre K. pneumoniae y D. discoideum.
• D. rerio es un modelo de hospedero con un sistema inmune innato similar al humano, por lo que se usa para el estudio de interacciones patógeno-hospedero y de la respuesta inmune. Peces con macrófagos marcados con fluorescencia permiten obtener imágenes no invasivas de células vivas durante las etapas con transparencia óptica y tempranas del desarrollo, permitiendo así el examen directo y en tiempo real de la respuesta del hospedero durante la infección. Se desconoce si K. pneumoniae puede infectar larvas de D. rerio, que cuenta con ciertas ventajas respecto a su forma adulta como modelo de hospedero, como una manipulación más fácil, la transparencia óptica y tamaño poblacional mayor, permitiendo un mejor análisis estadístico.
• Se aprovechan ambos modelos de hospedero para el estudio de los rasgos de virulencia de 3 aislados clínicos de K. pneumoniae. ATCC 700603 es una cepa multirresistente con SHV-18, una β-lactamasa de espectro extendido. BAA-1705 es una cepa multirresistente con producción de carbapenemasa KPC-2. RYC492 es una cepa productora de microtoxina E492 que intoxica a enterobacterias, con efectos antitumorales y que forma fibras amiloides moludando su toxicidad. Los determinantes génicos para la producción de E492 y de sideróforos similares de salmoquilina se ubican en una isla genómica prevalente principalmente en aislados hipervirulentos de K. pneumoniae. Los ensayos con los dos modelos permitieron comparar rasgos relacionados con la virulencia de las 3 cepas de K. pneumoniae, como la resistencia a la fagocitosis, la supervivencia intracelular, la colonización intestinal, el reclutamiento de neutrófilos y la letalidad. Se observa diferencias notables en las estrategias de virulencia entre diferentes cepas de esta especie, siendo la cápsula como un determinante mayor para la patogénesis en estos modelos.

Materiales y métodos:

• Cepas bacterianas y plásmidos: se cultivaron a 37°C y agitación 180 rpm en caldo LB hasta la fase de crecimiento tardía exponencial. El marcado de fluorescencia se logró por transformación de las cepas por electroporación con pFCcGi, que permite la expresión de la proteína mCherry o con pFCcGi-TMP, un plásmido derivado del anterior donde también expresa dihidrofolato reductasa, otorgando resistencia a trimetoprim e interrumpiendo el gen β-lactamasa.

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