Extracción de Plásmido

Universidad de Panamá

Facultad de Medicina

Laboratorio de Biología Molecular y Celular 2

Laboratorio #6 Parte A

Extracción de Plásmido

Profesora: Maribel González

Arrocha Dania 2-734-188

Barrios Rubieric  7-709-2383

Evers Elvia       8-888-479

Lujan González 8-890-2500

Jasón González 4-777-1889

González Mónica 6-718-2115

Melendez Angie 8-888-1987

López  Nicole     4-824-520

Salón 2.1 A

Lunes  12 de Abril de 2014.  

 INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb.El término plásmido fue presentado por primera vez por el biólogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952

La tecnología del ADN recombinante ha revolucionado el estudio de la célula y la molécula de ADN  ha pasado a ser una de las más fáciles de estudiar. Desde el año 1953, cuando Watson y Crick propusieron el modelo de la doble hélice como estructura del ADN se han obtenido innumerables avances en el campo de la biología molecular y se han desarrollado muchas técnicas genéticas sofisticadas. La construcción de moléculas de ADN recombinantes y artificiales se denomina Ingeniería Genética, a causa de su potencial para crear nuevas combinaciones genéticas por medios bioquímicos. El proceso también se denomina Clonación molecular o clonación genética, porque se pueden propagar en una estirpe de organismos genéticamente idénticos, los cuales todos contienen la molécula compuesta y al crecer la amplifican, así como cualquier producto génico cuya síntesis sea dirigida por ella.

Existe una gran variedad de métodos para el aislamiento de ADN plasmídico, en particular para aquellos plásmidos encontrados en Escherichia coli y otras enterobacterias. Estos métodos se diferencian en la pureza del producto final, en el tiempo necesario para llevarlos a cabo y en la posibilidad de aplicarlos en aislamientos a pequeña o gran escala; sin embargo todos incluyen tres etapas comunes:

1- crecimiento de las bacterias y amplificación del plásmido.

2- cosecha y lisis de las bacterias.

3- purificación del ADN plasmídico.

La mayoría de los métodos explota, de una u otra forma, las diferencias existentes entre el DNA cromosómico y el ADN plasmídico:

◊        El pequeño tamaño de los plásmidos en relación con el cromosoma bacteriano.

◊        La mayor parte del ADN cromosómico extraído de bacterias se obtiene fragmentado, en moléculas lineales, mientras que el ADN plasmídico se obtiene en forma circular.

◊        Las propiedades distintivas del ADN circular, cerrado en forma covalentes (CCC covalently closed circular).

En los protocolos para el aislamiento de plásmidos de bacterias Gram-negativas, el primer paso es lisar las células por tratamiento con EDTA, en algunos casos se utiliza una enzima denominada lisozima. El EDTA desorganiza la membrana externa generando esferaplastos. La reacción se realiza en presencia de sacarosa u otro azúcar para evitar la inmediata lisis osmótica  de los esferoplastos. Estos son lisados, posteriormente, por el agregado de un detergente y luego de esta etapa los restos celulares y los fragmentos de cromosoma bacteriano unidos a la membrana son eliminados por centrifugación mientras que el ADN plasmídico permanece en solución.

OBJETIVOS

Objetivo general

• Extraer ADN cromosómico y ADN de plásmidos de bacterias

Objetivo específico:

• Describir las diferencias entre la extracción de ADN cromosómico y ADN de plásmidos.

METODOLOGÍA

1. Luego de la explicación de la profesora comenzamos nuestro trabajo con las preparaciones de las soluciones a utilizar durante la extracción.

• P1: 50 mM glucosa, 25 mM Tris-HCL pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0. Mantener en hielo.
• P2: 0.2 NaOH, 1% SDS. Se deja a temperatura ambiente.
• P3: 3M KOAc, pH 6.0. Para 100 mL solución, 60 mL 5M acetato de potasio, 11.5 mL ácido acético glacial y 28.5mL H2O. Se almacena con hielo.

2. Seguidamente iniciamos con el proceso de extracción del plásmido, centrifugando por 3 min a 1000rpm en un tubo de microcentrífuga 1 mL del cultivo.

3.  Luego, pudimos observar como el pellet queda en el fondo del tubo y procedemos a descartar el líquido sobrenadante.

4. Después, agregamos 100 μl de P1 y 100 μl de P2, golpeando suavemente el pellet para desprender.

5. Mezclamos ligeramente el tubo unas 5 o 6 veces.

6. Agregamos al tubo 150 μl de P3 y mezclamos 5 o 6 veces.

7. Dejamos reposar el tubo en hielo por 10 min.

8. Procedimos a centrifugar por 10 min el tubo a 1000rpm.

9. Extraemos el líquido sobrenadante, cuidando de no tocar el pellet.

10. Medimos la cantidad de líquido extraído.

11. Dependiendo de la cantidad de líquido extraído, agregamos 2.5 o 3 veces esta cantidad de etanol al 95-100% para incrementar el rendimiento del DNA; mezclar 5 o 6 veces.

12. Dejamos el tubo en hielo por 30 min.

13. Centrifugamos el tubo por 10 min a 1000rpm.

14. Descartamos el líquido sobrenadante en el tubo, cuidando no tocar el pellet.

15. Agregamos al tubo 300 μl de etanol al 70%.

16. Centrifugamos una vez más el tubo por 5 min a 1000rpm.

17. Finalmente, descartamos el líquido sobrenadante y agregamos 50 μl de TE para suspender el plásmido.

DISCUSIÓN

1.Investigue cómo el EDTA  funciona en el buffer de resuspensión

El EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético) funciona en el buffer de resuspensión ya que se une a los cationes divalentes  Dado que los  iones ayudan a mantener la integridad de la membrana celular, la eliminación de estos con EDTA desestabiliza la membrana. 

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