Extracción de ADN de células eucariotas (Alverjas) mediante método semi-convencional y análisis del resultado por electroforesis

Extracción de ADN de células eucariotas (Alverjas) mediante método semi-convencional y análisis del resultado por electroforesis.

INTRODUCCIÓN:

Es una molécula constituida de un azúcar desoxirribosa y un grupo fosfato. Está formada por dos cadenas de polinucleótidos unidos por puentes de hidrógeno. En las cadenas de ADN se presentan los nucleótidos: timina (T), adenina (A), guanina (G) y citosina (G); quienes cumplen la función de formar genes, genes capaces de determinar las características biológicas de todo ser vivo (Alberts, 2010).

El ADN se encuentra en todas las células presentes en seres vivos. En las células procariotas el ADN se encuentra disperso en el citoplasma. Y por el contrario en las células eucariotas está ubicado dentro del núcleo, donde está asociado con proteínas y ARN (Alberts, 2010)[pic 1]

El ADN al ser una molécula larga puede ciertamente ser visualizada, también su extracción resultará sencilla ya que el ADN se encuentra en todas las células de todos los organismos vivos, para ello se requiere un procedimiento que implique la ruptura de las células, la separación del ADN de otros componentes celulares y por último la precipitación de este molécula de vida (University of UTAH, 2016).

En la presente práctica se mostrará el proceso realizado para la obtención de ADN de células vegetales, en este caso  la alberga. La hipótesis planteada es “Al romper la pared celular, membrana plasmática y membrana nuclear, el ADN de la célula puede ser aislada”

MATERIALES:

-Experiencia 1

• Licuadora
• Agua
• Alverja
• Sal de mesa
• Vasos de precipitación
• Colador
• Detergente liquido
• Tubos de ensayo
• Ablandador de carne (Enzimas)
• Alcohol 96 % frio
• Buffer
• Tubos de micro centrifuga

-Experiencia 2

• Muestras de DNA
• Micro pipeta
• Tubos de micro centrifuga  
• Caja de electroforesis
• Gel (0.5 agarosa)
• Buffer de tinción
• Fast blas (tinte catiónico)
• Equipo de electroforesis

PROCEDIMIENTO:

-Experiencia 1

 Se pelo, cortó y colocó las alverjas en un vaso de precipitación en 100mL aforados, después se puso agua hasta alcanzar un volumen de 200 mL. También se colocó 1 g de sal de mesa. Se procedió a licuar todo hasta que se vea como una mezcla homogénea y filtrar en el vaso de precipitación. Este es un proceso para romper las estructuras celulares.

Añadir a la disolución antes filtrada 30 mL de detergente líquido, mezclar bien evitando la formación  de espuma. Este proceso nos ayudara a romper las cadenas lipídicas existentes en el núcleo celular  y así liberar el DNA. Dejar reposar por 10 min para que el detergente haga efecto.

Después de esto se coloca la mescla en un tubo de ensayo, en el que solo debe ocupar un tercio, para poder seguir con los siguientes procesos.  

Para la digestión enzimática se colocó a la muestra una pequeña porción  de enzimas (suavizante de carne) tomada con la espátula, se agito ligeramente ya que los movimiento bruscos hacen que las cadenas de DNA se rompan. Se dejó que repose por diez minutos para que se separen las proteínas histonas del ADN.

A la anterior mezcla en el tubo de ensayo se le coloco una cantidad proporcional de alcohol. Esto hizo que haya una separación de unos pequeños hilos entre el alcohol colocado y la mezcla. Estos pequeños hilos que se obtuvieron tomaron el nombre de ADN en nuestra práctica.

Para la extracción de ADN se empleó un gotero  y para la conservación del mismo se tuvo que colocar 1 mL  de buffer en un tubo de micro centrifuga y se puso ahí lo que se tomó con el gotero anteriormente. Par poderlo utilizar en la siguiente experiencia (después de 8 días) se lo refrigero a 4°C.

-Experiencia 2

Se hizo una disolución de agarosa, 0,5 g en 100 mL, que se tuvo que calentar hasta lograr una mezcla de consistencia gelatinosa; esto se colocó en una caja de electroforesis anteriormente armada con un peine de 14 agujeros (Fig.1). Mientras la mezcla colocada en la caja de electroforesis formaba un gel, se procedió a la preparación de las muestras de la experiencia 1.  

[pic 2][pic 3][pic 4][pic 5]

 Con la ayuda de una micro pipeta se extrajo de la muestra 10 μL y se la coloco en un tubo de micro centrifuga, procurando que no queden esparcimientos ya que las cantidades que se tomó eran muy pequeñas. A esto se le añadió 2 μL de buffer de carga.

Una vez preparadas todas las partes antes descritas se procedió a sacar el peine del gel, y con el micro pipeta se colocó la disolución de la muestra con el buffer en los posos formados por el peine. Se encendió la máquina de electroforesis por 30 min, para que la disolución actúe según su carga.

Al final se procedió a colocar el gel en un tinte catiónico y después de 5 min se hizo un enjuague con agua, que se repitió en segunda ocasión  para conseguir nuestros resultados finales.      

RESULTADOS:

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