Extracción de la tirosinasa y determinación de su actividad en algunos vegetales

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Universidad de Guayaquil Facultad de Ciencias Químicas Carrera: Bioquímica y Farmacia Guía de Prácticas de Laboratorio

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Práctica No.9

Extracción de la tirosinasa y determinación de su actividad en algunos vegetales.

Objetivos de la práctica de laboratorio

• Estudiar la cinética enzimática de la tirosinasa en diferentes condiciones.
• Obtener un extracto enzimático a partir de tres fuentes vegetales;
• Evaluar la actividad enzimática de dichos extractos en condiciones normales, utilizando como sustrato la L-Dopa;
• Evaluar la actividad enzimática en presencia de inhibidores: ácido ascórbico y la acción del calor.

Instrucciones o consideraciones previas (marco teórico)

La tirosinasa es una metaloenzima multifuncional, que usa dos iones de cobre como cofactores. El sitio de unión de cobre es el sitio activo de la enzima. Esta enzima se distribuye casi universalmente a través de todas las formas de vida, desde bacterias hasta mamíferos. Es miembro de una gran familia de proteínas denominadas proteínas de cobre de tipo 3 y es una proteína clave que participa principalmente en la pasos iniciales de la vía de biosíntesis de melanina.

La tirosinasa está presente en mamíferos, invertebrados, plantas y microorganismos, donde participa en varias funciones biológicas críticas, como la pigmentación de la piel en mamíferos, la respuesta inmune primaria y los sistemas de curación de heridas en plantas y hongos, el pardeamiento reacciones en frutas y verduras, el sistema de defensa del huésped en artrópodos, la diferenciación de órganos reproductores y formación de esporas en hongos, y la esclerotización de la cutícula en artrópodos después de muda o lesión.

Es la enzima responsable del proceso de melanización en animales y del pardeo en vegetales. En mamíferos, se encuentra localizada en su mayor parte, en los melanocitos de la piel, asociada a las fracciones subcelulares correspondientes a los melanosomas y al retículo endoplasmático. La tirosinasa cataliza la conversión de l-tirosina en l-DOPA y luego en dopacromo, que posteriormente se polimeriza espontáneamente en melanina mediante una serie de reacciones de polimerización.

Soluciones y reactivos de laboratorio: 

Reactivos

• Ácido ascórbico
• Buffer de fosfatos de pH 7,2
• Buffer de pH 6
• L-Dopa

Muestras

• Muestras de origen vegetal: manzana, papa, banana

Materiales

• Cuchillo
• Embudo
• Espátulas
• Gradilla
• Hornilla eléctrica
• Mortero
• Papel de filtro
• Pinza para tubos
• Pipetas
• Probetas
• Termómetro
• Tubos de centrífuga
• Tubos de ensayo
• Vasos de precipitado
• Vidrio reloj

Equipos de laboratorio:

• Fotocolorímetro
• Centrífuga
• Sonda de adquisición de datos (Tableta LabQuest)
• Balanza

Técnica operatoria o procedimiento (Actividades por desarrollar)

Resultados obtenidos (cálculos, datos, tablas, gráficos y otros que así se consideren)

Conclusiones (la conclusión debe estar relacionada con el objetivo planteado en el Informe de laboratorio)

Recomendaciones (se deben colocar aquellas recomendaciones que se consideren)

Bibliografía

• Agarwal, P., Singh, M., Singh, J., & Singh, R. P. (2019). Microbial tyrosinases: A novel enzyme, structural features, and applications. In Applied Microbiology and Bioengineering (pp. 3-19). Academic Press
• Bettelheim, F. A., & Landesberg, J. M. (2012). Laboratory experiments for introduction to general, organic and biochemistry. Cengage Learning.
• Mathews, C. K., & Ahern, K. G. (2002). Bioquímica. Pearson Education.
• Roca, P., Oliver, J., & Rodríguez, A. M. (2004). Bioquímica: técnicas y métodos. Editorial Hélice.
• Sánchez, S. S.; Flores, L. J.; Gurrola, C.; Heredia, P. (2014). Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica. McGraw-Hill Interamericana.