Extracción y purificación del ADN Extracción y purificación: la primera etapa

UD 3: Extracción y purificación de ácidos nucleicos

Gorka Arriola

Extracción y purificación: la primera etapa

Lo primero de todo para poder realizar este proceso es la eliminación de membranas para hacer que los AN sean accesibles.

La obtención tiene 3 pasos:

1. Pretratamiento de la muestra
2. Extracción de los AN
3. Purificación de los AN

Pretratamiento de la muestra

El pretatamiento es diferente dependiendo del material de partida.

Suspensiones celulares: células libres y agregados celulares que flotan dispersos en el seno del medio líquido.

Dependiendo del tipo de muestra será diferente:

• SANGRE (hematíes + leucocitos + plaquetas)

• Purificación a partir de leucocitos
• El grupo hemo importante eliminarlo por lisis ya que es inhibidor PCR.
• Es interesante realizar los estudios con sangre tratada con EDTA y en las 24 horas siguientes a la extracción. Sino refrigerado a 4 grados 5 días

1. Para Southern blot no conservar más de tres días

• Lisis de hematíes:

1. Romper hematíes con tampón 1:3 (volumen sangre tres veces volumen solución lisis)
2. Se procede al centrifugado de la muestra donde tendremos un sobrenadante y un sedimento o pellet
3. Eliminación sobrenadante con una pipeta pasteur (elimina componentes plasma sanguíneo y la hemoglobina)
4. Conservación del sedimento (leucocitos)

• Obtención de células mononucleadas de sangre periférica

1. Virus: VIH, linfotrópicos…
2. Aislar PBMC
3. Centrifugación en gradiente densidad.

[pic 1]

• CULTIVOS CELULARES

• Obtención de células in vitro mediante siembras controladas
• Cultivos en suspensión:

1. Recolectar en tubo
2. Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación
3. Lavar las células con tampón o suero fisiológico antes de iniciar extracción

• Cultivos en monocapa:

1. Dos modos: utilizar frasco para seguir el proceso:

• Retirar el frasco del medio de cultivo
• Lavar la monocapa con tampón o solución salina
• Iniciar in situ el proceso de extracción

1. Pasar la monocapa a un tubo:

• Despegar la monocapa de la pared del frasco ( con raspador o con encimas)
• Recolectar células en un tubo
• Lavar las células antes de continuar con la extracción

• TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES FRESCOS

• Obtener AN a partir de tejidos frescos animales vegetales
• Requiere HOMOGENIZACION: Tratamiento al que se somete un tejido para liberar las células que lo integran.

1. Mecánica: Someter al tejido a una acción trituradora o abrasiva para desmenuzarlo.

• Automática: Usando maquinas o elementos mecánicos.
• Manual-mortero: Se cubre la muestra en nitrógeno líquido en un mortero y se procede a desmenuzarlo para la extracción.
• Química: Se somete al tejido a la acción de proteasas y detergentes que degradan los componentes tisulares disgregando las células.

• TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL E INCLUIDOS EN PARAFINA (FFPE)

• Desparafinizacion: eliminación de la parafina en los tejidos.

• OTRAS MUESTRAS:

• Cultivos de bacterias y levaduras

1. En medio liquido: se centrifuga el tubo para eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en el tampón de suspensión.
2. Colonias aisladas: se recoge una colonia de la superficie y se resuspende la colonia en un tampón de suspensión.

• Células de la mucosa oral: mediante raspado
• Esputo.

Extracción de los ácidos nucleicos.

Consiste en obtener un lisado celular de aspecto homogéneo en el que los AN se encuentran libres de las estructuras celulares que les mantenían aislados.

• LA SOLUCIÓN DE LISIS

• Detergentes:

• Componentes principales de la solución de lisis.
• Desestructura la bicapa lipídicas de las membranas.
• Más usado → SDS

• EDTA

• Quelante de cationes divalentes como el calcio y magnesio
• Inhibe actividad ADNasas

• Proteasas

• Digieren las proteínas, tanto las de membrana como las citoplasmáticas.
• Especialmente útil en muestras de tejido fresco

• Agentes caotrópicos

• Inactiva nucleasas desnaturalizando macromoléculas impidiendo que realicen su actividad

• TRATAMIENTO DE LAS CÉLULAS CON PARED CELULAR

• Tratamiento enzimático

• Usa enzimas especificas:

• Lisozima: para gram positivas
• Liticasa: células vegetales, levaduras y hongos

• Tratamiento mecánico

• Por ejemplo ebullición en agua destilada o tampón.

• Tratamiento con CTAB

• Agente iónico.

• Comprobar que se ha obtenido una solución homogénea
• SI no se ha obtenido una lisi homogénea: añadiremos solución de lisis y reincubaremos.
• Eliminación del ARN: Añadiremos ARNasa A y incubaremos 37ºC 15-45 min. eje: saliva

Purificación de los ácidos nucleicos.

Consiste en separar los AN de los demás componentes del lisado.

• PURIFICACIÓN CON SOLVENTES ORGANICOS

• Se basa en la distinta solubilidad de los compuestos que integran el lisado celular en solventes orgánicos.
• 4 fases:

• Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos:

• Usa fenol, cloroformo y alcohol isoamílico en 25:24:1
• Se juntan y se agitan con ayuda de un vortex
• Luego se centrifuga para separarlo en fases

• Precipitación del ADN

• Fase acuosa se transfiere a un tubo y el ADN se precipita usando acetato sódico e isopropanol

• Lavado de ADN

• Una vez eliminado el sobrenadante, el pellet de ADN se vuelve a centrifugar. El ADN al ser insoluble en ADN se mantiene ahí mientras que el resto se disuelve en el.

• Resuspensión del ADN

• Antes de resuspender eliminar todo el etanol (invirtiendo el tubo en material absorbente)
• Una vez seco en cantidad adecuada de agua o un tampón neutro o ligeramente alcalino
• Rehidratación proceso lento.

[pic 2]

• PRECIPITACIÓN CON SALES (SALTING-OUT)

• Se basa en la precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas.
• 3 fases

• Precipitación proteínas

• Al lisado añadir un volumen igual de solución salina concentrada y agitar
• Centrifugar y quedarse con el pellet que serán las proteínas

• Precipitación del ADN

• Sobrenadante transfiere a un tubo limpio y se añade un volumen igual de isopropanol y mezclar con inversiones suaves.
• ADN precipita en forma de maraña que se sedimentan mediante centrifugación.

• Lavado y Resuspensión del ADN

• Elimina sobrenadante y resuspende en agua destilada o tampón.

• CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

• Se basa en la unión electrostática reversible de iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria.
• Procedimiento        

• En la columna de cromatografía  se cargara con una disolución de lisado en un tampón baja salinidad y pH neutro.
• La columna se lava con tampones de concentración salina creciente. Elimina contaminantes con débil carga negativa
• El ADN  se eluye de la columna con un tampón de máxima salinidad y alto pH

• CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN

• Se basa en la capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos al vidrio y a la sílice en presencia de sales caotrópicas.
• Procedimiento:

• La columna se carga con el lisado diluido en un tampón con un agente caotrópico y se centrifuga.
• Los AN unidos a la membrana se lavan con etanol 70% para eliminar restos contaminantes. Para evitar tener restos de alcohol se centrifugara dos veces
• La columna se ajusta a un tubo de Ependorf limpio y se añade la cantidad adecuada de agua destilada o de tampón TE.

• PURIFICACION MEDIANTE ESFERAS MAGNETICAS

• Se basa en la unión de los ácidos nucleicos a microesferas magnéticas que pueden ser retenidas mediante imán.
• Procedimiento:        

• Las esferas se añaden al lisado junto con agentes caotrópico, de manera que los ácidos nucleicos se unen a la superficie de las esferas
• El tubo de la mezcla se coloca en soporte con un iman de manera que las esferas se agruparan
• Resto se elimina
• Para lavar AN se retira el tubo del separador magnetico y se añade etanol 70%. Se vuelve a aglutinar y la solución de lavado se elimina.
• Se resuspenden los AN con agua destilada o tampón y se incuba.
• Se retiran las esferas con ayuda del imán (ya sin AN)

• ULTRAFILTRACIÓN

• Se basa en la retención por tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos mediante membranas con un tamaño de poro determinado.
• Procedimiento:

• La muestra se carga directamente en la columna y se centrifuga.
• Filtro se lava con etanol para eliminar contaminantes
• Se resuspende con agua o con tampón TE. Se incuba y se transfiere a otro tubo limpio.

Automatización del proceso de extracción/purificacion

Ventajas:

• Garantiza la obtención de AN altamente purificados
•  Minimiza la contaminación de proteínas
• Evita la contaminación cruzada de muestras
• Aporta la rapidez (< 1 h)

Tipos de instrumentos automáticos:

• Basado en partículas magnéticas
• Basados en cromatografía de adsorción
• Instrumentos modulares

Calidad de los ácidos nucleicos

Parámetros que determinan la calidad:

• Integridad: determina si un AN conserva su tamaño original

• ADN genómico
• ADN plasmídico
• ARN

• Pureza :determina la ausencia de posibles contaminantes

• Cociente A260/A280, Cociente A260/A230, Absorbancia 320 nm

• Concentración: cantidad de AN por unidad de volumen de solución final. (ver conversión unidades)

•  Absorbencia 260 nm
• Concentración de AN = (A260-A320)x factor dilución x factor convesión –
• Fluorescencia

Almacenamiento de los ácidos nucleicos purificados

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