GENERALIDADES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA

GENERALIDADES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA

José Sánchez 4-783-1894

Caleb Murillo 4-781-262

Carol Guerra 4-772-1639

Kimberly Caballero 4-783-1246

Universidad Autónoma De Chiriquí, Facultad De Ciencia Naturales Y Exactas, Escuela De Biología, Laboratorio De Biología 125, Profesora: Auristela Acosta.

Resumen: La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe o transmite un sistema o muestra en función de la longitud de onda; es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.  

La determinación de la glucosa y colesterol se realizan mediante este método, utilizando el espectrofotómetro. En nuestro laboratorio como primer paso se hizo la extracción de sangre siguiendo los parámetros y cuidados establecidos.  Luego por centrifugación se obtuvo el suero,  que es nuestra muestra a evaluar. El reactivo de trabajo (RT) ya venía preparado, con todas las enzimas y tapones necesarios para que las reacciones se efectúen correctamente. Como en todo análisis cuantitativo existen errores ya sea del instrumento como de nosotros.  Por eso se hace una primera medida con una solución de referencia o blanco, que contiene todos los compuestos que intervienen en la lectura  menos el que se desea medir; además preparamos una solución estándar, para calibrar el espectrofotómetro y saber qué cantidad de luz puede ser absorbida por las muestras para compararlas con las demás muestras a evaluar, cabe mencionar  que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración, por  lo tanto, si la muestra tiene un color muy intenso la absorbancia de luz será abundante, eso quiere decir que la concentración de glucosa o colesterol aumenta con la intensidad en el color de la muestra. Como último paso se preparó las muestras, cada una con 10µL de suero  y se introdujeron una por una en el espectrofotómetro, así determinamos la cantidad de luz absorbida y calculamos la concentración tanto de glucosa como de colesterol en la sangre y determinar si están dentro de los rangos aceptables.

Principio del método

Determinación cuantitativa del colesterol

El colesterol presente en la muestra origina un compuesto coloreado según la reacción siguiente:

Esteres colesterol + H2O     che           colesterol  + ácidos grasos [pic 1]

Colesterol  +  O2         CHOD            4-colestenona  + H2O2 [pic 2]

2 H2O2  + fenol + 4-Aminofenazona         POD             Quinonimina + 4H2O[pic 3]

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de colesterol presente en la muestra ensayada. Esto quiere decir que entre mayor intensidad de color, mayor será los niveles de colesterol y por el contrario, menos intensidad de color, menor es la concentración de colesterol en la sangre de ese individuo.

Explicando las reacciones, las enzimas que interviene son proporcionadas por el reactivo, cada reacción se reproduce una vez agregada la sangre a los tubos servidos con el reactivo para completar el análisis clínico.

El significado clínico: el colesterol es una sustancia grasa presente en todas las células del organismo. El hígado produce naturalmente todo el colesterol que necesitamos para formar la membrana celular y producir ciertas hormonas. El aumento de este propicia factores de riesgo cardiovascular.

Determinación cuantitativa de la glucosa

La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El peróxido de hidrogeno producido se detecta, mediante un aceptor cromo génico de oxígeno, fenol-ampirona en presencia de peroxidasa.

Β-D-Glucosa + O2 + H2O     GOD      ácido gluconico + H2O2 [pic 4]

H2O2  + fenol + ampirona     POD      quinona + H2O2[pic 5]

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra. Alto niveles de glucosa nos lleva a muchas enfermedades, entre las cuales la diabetes.

Proceso reactivo:

1.        La glucosa se oxida por acción dela glucosa oxidasa para dar  ácido glucónico y peróxido de hidrógeno.

2.        El peróxido de hidrógeno reacciona en presencia de peroxidasa con HBA y con 4-aminoantipiridina (4-AAP) para dar lugar a un tinte de Quinonimina rojo. Se puede medir fotométricamente entre 460y 560nm.

Resultados y cálculos

Glucosa

El examen cuantitativo de la glucosa se puede realizar por medio de cuantificación de la quinona  producida por la reacción β-D-Glucosa, los datos obtenidos por la cuantificación se pueden expresar por la absorbancia que es la cantidad de luz absorbida por la muestra  y concentración de la glucosa en la muestra. Estos valores son obtenidos gracias al espectrofotómetro.

Calculo

% de absorción= (Tblanco-Tmuestra) x100

% de absorción= (0,2805-0,1348) x100

% de absorción= 14,57

(Mg/dL)=[pic 6]

(Mg/dL)=[pic 7]

(Mg/dL) glucosa= 48mg/dL

Cuadro1. Determinación cuantitativa de la glucosa

• Se presenta una variación significativas en las diferentes muestras con respecto al valor del patrón en relación a la concentración observada en las muestras teniendo en cuenta el rango de aceptación es de  60-110 mg/dL  estando todos los valores por fuera del rango de aceptación más sin embargo, se pueden explicar estos valores por los motivos:

Se observa una propagación de errores ya que los reactivos se encontraban contaminados y vencidos de igual manera la reproducibilidad ya que el muestreo fue reproducido por diferentes estudiantes, al momento de pipetear  no se obtuvo la cantidad necesaria para un correcto conteo de igual manera al momento de agregar los reactivos se produce el mismo error siendo así estos resultados pocos confiables por la propagación de  error.

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