HERENCIA PATERNAL DE ADN MITOCONDRIAL

HERENCIA PATERNAL DEL ADN MITOCONDRIAL

ADN MITOCONDRIAL MAMÍFEROS

(ADNmt) se piensa que es estrictamente maternalmente mitocondrias inherited. esperma desaparecen en la embriogénesis temprana por la destrucción selectiva, la inactivación, o la dilución sencilla por la gran excedente de mitochondria.3 ovocito Cantidades muy pequeñas de ADN mitocondrial heredado del padre han sido detectadas por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en ratones después de varias generaciones de interespecífica Estudios backcrosses.4 de tales híbridos y de ratón ovocitos con los espermatozoides microinyección apoyan la hipótesis que las mitocondrias de esperma son objeto de la destrucción por proteins.5-7 codificada en el núcleo Presentamos el caso de un hombre de 28 años de edad, con miopatía mitocondrial debido a una deleción ADNmt novela de 2 pb en el ND2 gen (también conocido como MTND2), que codifica una subunidad del complejo enzima I del mitocondrial cadena respiratoria. Se determinó que el ADNmt portadoras de la mutación fue origen paterno y representaron el 90 por ciento de los músculos del paciente ADNmt.

REPORTE DE UN CASO

El paciente era un hombre de 28 años de edad, con el ejercicio intenso, de toda la vida intolerancia. Nunca había sido capaz de ejecutar más de unos pocos pasos.Sus funciones cardíacas y pulmonares fueron normales, y él era lo contrario bien. Ambos padres y una hermana de 23 años de edad, estaban sanos y tenían tolerancia normal ejercicio. Los síntomas de miopatía se asociaron con la acidosis láctica severa inducida por el esfuerzo físico menor. Su nivel de lactato en plasma después de caminar 100 metros a un ritmo más lento fue de 6 a 8 mmol por litro (la nivel normal está por debajo de 2,5 mmol por litro). Sus niveles de creatina quinasa fueron elevados marginalmente en períodos sin esfuerzo físico. Las biopsias del músculo cuádriceps derecho e izquierdo reveló que 15 por ciento de las fibras eran del tipo irregular-rojo, un resultado consistente con la acumulación de mitocondrias anormal con respiratoria deteriorada función. El análisis bioquímico ha demostrado una deficiencia aislado del complejo enzima mitocondrial I de la cadena respiratoria en el músculo. No había signos de atrofia muscular o debilidad. Los hallazgos anormales en especímenes de biopsia de músculo de ambos muslos y el hallazgo de discapacidad grave extracción de oxígeno cuando los músculos del antebrazo fueron repetidamente contracted8 sugirieron generalizada afectación muscular.

MÉTODOS

Se aisló el ADN de las raíces de la sangre, músculo, pelo del paciente, y fibroblastos (derivadas de una biopsia de piel) por métodos estándar. ADN también se aisló de la sangre de los padres del paciente y tío paterno, y de la sangre y el músculo cuádriceps de La hermana de la paciente. El ADNmt se amplificó en dos productos con el OLA cebadores (5756-5781) + D1B (282-255) y D1A Se purificaron (336-363) + OLB (5.745 a 5721), 9 y los productos. Hemos secuenciado la mayor parte del ADN mitocondrial, incluyendo todos los ARN de transferencia (ARNt) genes, cytB, y todos los siete genes que codifican subunidades de enzima Complejo I, usando un analizador genético (ABI PRISM 310, Applied Biosystems) y una lista de reacción terminador de ciclo de secuenciación kit (ABI PRISM BigDye, Applied Biosystems). las secuencias de obtenidos se compararon con la referencia Cambridge revisado sequence10,11 (AC J01415) con el uso del programa DNASIS (Hitachi Ingeniería de Software Europa). Dos diferentes haplotipos de ADNmt fueron encontrados en el paciente; presumiblemente, vino uno del padre y otro de la madre.

minisequencing12 en fase sólida se realizó para establecer la proporciones de ADNmt haplotipos en la sangre y el músculo. El objetivo era la posición del nucleótido 3197, que, entre otros, distinguido el haplotipo materna (3197T) a partir de la paterna (3197C).

Los productos de PCR que abarca la posición en cuestión se generaron el cebador 5 'biotinilado hacia adelante (3.014 a 3.034) y la inversa imprimación (3376-3356). Los productos de PCR se inmovilizaron sobre un revestido con estreptavidina soporte sólido (placa de 96 pocillos) y se desnaturalizó por el sodio hidróxido. Un cebador de secuenciación (3220-3198) fue diseñado recocer adyacente a (aguas arriba de) el nucleótido 3.197.

El nucleótido en la posición 3197 se analizó por el cebador reacción de extensión, en la que un desoxinucleósido trifosfato marcado con tritio correspondiente a ya sea el nucleótido materna (desoxiadenosina trifosfato) o el nucleótido paternal (desoxiguanosina trifosfato) se añadió a dos reacciones paralelas. Después del lavado, los cebadores alargados se eluyeron por hidróxido de sodio, y la cantidad de monofosfato incorporada [3H] era desoxinucleósido se determinó con un contador de centelleo líquido. Las proporciones de adenina a la guanina incorporado en cada cebador de secuenciación fueron determinados y en comparación con los valores de una curva patrón construida sobre la base de las proporciones conocidas de segmentos clonados de ADNmt albergar 3197T y 3197C, respectivamente. La relación de la deleción de 2 pb de tipo salvaje ADNmt en tejidos (El nivel de heteroplasmia) se determinó por análisis de fragmentos de PCR. El ADN mitocondrial se amplificó por la 5'-fluorocromo marcado con hacia adelante cebador (5041-5060) y el cebador inverso (desde 5.196 hasta 5177).

Los productos de PCR se analizaron en un analizador genético con una estándar GeneScan (PE Applied Biosystems) como marcador de tamaño. Los Se utilizaron áreas del mutante (supresión 2-bp) y de tipo salvaje picos para calcular el porcentaje de mutante (paternal) ADNmt en el paciente de músculo.

Los genotipos nucleares del paciente, sus padres y su hermana se determinaron los marcadores altamente polimórficos (microsatélites) D7S2212, D7S817, D19S219, D19S559, y TNFb. PCR productos se analizaron en un analizador genético con el software GeneScan (Applied Biosystems) y un estándar de GeneScan como marcador de tamaño.

El paciente y su familia dieron su consentimiento oral para después de la prueba recibir asesoramiento. consentimiento por escrito no fue requerido por el junta de revisión institucional porque la investigación se consideró parte de la atención clínica.

RESULTADOS

La secuenciación del genoma mitocondrial de un espécimen de una biopsia del músculo cuádriceps reveló una deleción de 2 pb, 5132delAA, en el ND2 gene. La supresión de 2 pb provoca un cambio de marco, introduciendo un codón de parada aguas abajo de la eliminación. Además, una nueva variante, 1303G → A, se detectó en el ARN ribosomal 12S gen que codifica (rRNA). El 1303G → Una variante no se encontró en 50 normales controla, pero un análisis mostró que esta conservación posición no se conserva a través de la evolución (Tabla 1). El paciente fue aparentemente homoplasmic (sólo una tipo de ADNmt estaba presente), tanto para la supresión de 2 pb y 1303G → A. El paciente también albergaba variosconocidos polimorfismos del ADN mitocondrial. Para evaluar la relación de normal a ADNmt mutante (Heteroplasmia) en otros tejidos, se analizaron ADNmt de la sangre del paciente, las raíces del pelo, y cultivos de fibroblastos. Ni el 1303G → Una variante ni el 2-bp deleción estaba presente en el ADNmt de estos tejidos. En De hecho, las secuencias de ADNmt de sangre y músculo diferían en 18 posiciones, algunas de las cuales permitió la asignación de las dos secuencias para separar haplogrupos de ADN mitocondrial Europea, H y U5, respectivamente (Tabla 2 y Fig. 1).

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