Informe Biología Molecular – Extracción de DNA a partir de sangre total humana por el método salting out

Informe Biología Molecular – Extracción de DNA a partir de sangre total humana por el método salting out

Procedimiento y materiales

Para el desarrollo de este laboratorio se utilizó una muestra central: sangre humana, además de otros reactivos y soluciones para llevar a cabo el procedimiento de salting out, adicionalmente elementos de laboratorio básicos para la práctica de extracción de DNA.

En primer lugar se encuentra el uso de la centrifugadora, para realizar la obtención de la muestra y la purificación de las células blancas. Este proceso inició con la toma de 5ml de sangre total, mediante punción venosa, recogida en un vacutainer. Posteriormente, se centrifugó a 3000 rpm durante 3 minutos. Seguido de esto se recuperaron, con micropipeta, los glóbulos blancos y se los depositó en un tubo eppendorf con 400 μl de TE 10X (1:1). Se llevó al baño de hielo cada muestra durante 10 minutos. De nuevo, usando la centrifugadora, se centrifugó a 6000 rpm por 5 minutos, se descartó el sobrenadante y se adicionaron 4000 μl de TE 10X. Finalmente, se repitieron los pasos 5 y 6 hasta observar limpio el pellet. En el pellet blanco se encontró respectivamente el DNA.

Seguidamente, se iniciaron los procedimientos de lisis celular y desproteinización. Para esto se adicionó al pellet 200 μl de buffer lisis, además de 3 μl de proteinasa K [20mg/ml] + 100  μLSDS 10%. Esto se llevó al baño maría a 65°C durante 35 minutos. Inmediatamente después se llevó a -20°C, por 10 minutos. Para terminar esta parte se adicionó 300 μl de NaCl al 5M y se agitó 40 segundos con vórtex.

Para el último proceso de purificación, se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minutos. Se tomó toda la muestra completa de sobrenadante y se pasó a un tubo eppendorf nuevo estéril. Se adicionaron dos volúmenes (correspondientes a 800μl) de etanol absoluto frío y se mezcló por inversión, durante 15 segundos; en este punto se observó la pequeña malla de ADN poniendo el tubo a la luz. Se descartó el sobrenadante por completo, adicionando después 1ml de etanol al 70%. Se mezcló por inversión durante 2 minutos. Para concluir, se centrifugó a 14000 rpm por 5 minutos. Los últimos pasos para la extracción del ADN incluyeron descartar el sobrenadante, dejar evaporar el etanol a temperatura ambiente y adicionar 10 μl de TE 1X, conservándolo a -20°C.

Después de la práctica de extracción de ADN, se debe realizar una verificación de dicha extracción. Para esto se desarrolla una electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, coloreado con bromuro de etidio. *

Materiales

• Vacutainer
• Tubos eppendorf
• Nevera
• Papel absorbente
• Centrífuga refrigerada
• Vórtex
• Pipetas
• Micropipetas
• 300 μl de buffer lisis x 3

Reactivos

• Etanol absoluto frío
• TE 1X
• Tris EDTA (10X)
• Tris HCl pH 8.0
• NaCl 5M buffer lisis 300 μl
• EDTA 1mM
• SDS 10%
• Proteinasa K (20mg/ml)
• Baño de hielo

Discusión – parte 1

Entre diversos métodos de extracción de DNA (salting out, extracción de DNA por método modificado "Preparation of Genomic DNA from Mouse Tails y Other Small samples y extracción de DNA por kit comercial) se tiene la hipótesis que se obtendrá mayor cantidad de DNA por el primer método, salting out, lo cual permitirá una exitosa amplificación posteriormente. En este caso, la cantidad de DNA que se obtuvo fue mínima y poco visible para cada uno de los grupos. Esto pudo deberse a que las muestras tomadas fueron mínimas, además de la influencia directa de las condiciones del laboratorio, elementos, errores mecánicos, entre otros.

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