LABORATORIO HISTOQUÍMICA 2013. ÁCIDOS NUCLEICOS

LABORATORIO HISTOQUÍMICA 2013.

ÁCIDOS NUCLEICOS

Son macromoléculas constituidas por nucleótidos, unidos por enlaces fosfodiéster, que a la vez se componen de:

• Grupo fosfato: componente ácido ubicado externamente (C5 de la pentosa).
• Pentosa: azúcar de 5 carbonos (pueden identificarse por reactivo de schiff).
• Bases Nitrogenadas: región hidrofóbica en el centro de la hélice; forman un apilamiento con sus anillos aromáticos planares, perpendiculares al eje mayor de la molécula. Se separan una de la otra por 0.36nm.

El diámetro externo de la doble hélice de DNA es 1.8nm

Las proteínas histonas se encargan de neutralizar la región ácida del DNA.

[pic 1]

1) FEULGEN

Fundamento.

- La técnica de felugen identifica selectivamente DNA a través de la unión del reactivo de schiff al aldehído generado en la pentosa gracias a la hidrólisis ácida.

- La hidrólisis se realiza dependiendo del fijador ya que algunos fijadores como la formalina, actúan por reticulación, formando abundantes puentes de metileno. En el caso del bouin, la hidrólisis se deja actuar más tiempo debido a que el ácido pícrico se comporta como sal, y no como ácido. Sin embargo no está recomendado para ácidos nucleicos.

- El HCl separa la pentosa de la base nitrogenada rompiendo el enlace nucleósido del C1’ de la pentosa. La hidrólisis se realiza de bases nitrogenadas púricas (A y G) y en pequeñas cantidades las bases pirimidínicas. La hidrólisis genera que se formen grupos aldehídos en el C1’ de la pentosa.

- La hidrólisis excesiva puede generar pérdida de enlaces fosfodiéster con lo que se pierde la estructura polimérica del DNA.

- El agua sulfurosa vuelve un leuco derivado a las moléculas de reactivo de schiff que no se unieron al tejido (Bloqueo de coloración), para posteriormente eliminarlas en los lavados con agua destilada.

- Los grupos aldehídos endógenos presentes en el tejido o producidos por el fijador, pueden ser removidos tratando el tejido con borohidrato de sodio antes de ser teñido.

- El RNA no se tiñe porque en el C2 de la pentosa hay un grupo hidroxilo, generando un impedimento para la coloración con la molécula del reactivo de schiff. Las bases de RNA no están a la distancia adecuada para reaccionar con el reactivo de schiff (debe estar a 1 o 1,1 nm).

- Baño debe estar ya a 60°C al momento de poner la placa en el baño 🡪 medir la T°C

- Carbón activado filtra desechos de potasio o sodio 🡪 para asegurarse de que quede el leucoderivado

Fijación: Alfac, carnoy, zenker.

Soluciones.

1. Reactivo de Schiff

• Fucsina Básica                                                                0.5 gr
• Agua destilada                                                               90 ml
• Ácido clorhídrico                                                            10 ml
• Metabisulfito de Na o K                                                0.5 gr
• Carbón vegetal activado                                               0.1 gr

• Disolver fucsina básica en agua destilada hirviendo. Enfriar a 50°C. Filtrar, agregar ácido clorhídrico. Enfriar a 25°C y agregar metabisulfito de Na. Dejar reposar en la oscuridad por 24 hrs. Agregar carbón activado, agitar y filtrar. El resultado debe ser una solución incolora. Conservar en la oscuridad a 4°C. Tonalidad rosada indica que está envejecido.

1. Agua Sulfurosa

• Agua destilada                                                               90 ml
• HCl 1N                                                                               5 ml
• Metabisulfito de K al 10%                                              5 ml

*HCL 1N: HCl 8.27 ml en 91.7 ml de agua destilada.

Protocolo.

1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
2. Hidrolizar en solución HCl 1N (tiempo según el fijador usado) en baño termoregulado a 60°C→ aprox 8-10 min (en formalina).
3. Detener hidrólisis en 1 cambio de agua destilada fría y 2 cambios de agua destilada fría (5 min c/u).
4. Colocar en Reactivo de Schiff durante 30-60 minutos.
5. Pasar directamente a 3 cambios de agua sulfurosa recién preparada (5 min c/u).
6. Lavar en agua corriente y luego en agua destilada por 10 minutos.
7. Contrastar con verde luz al 1% por 20 segundos.
8. Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados: DNA color fucsia. Fondo color verde claro.

* Tiempos de hidrólisis:

- Bouin 🡪 12 min

- Carnoy 🡪 8 min

- Zenker 🡪 5 min

- Formol 🡪 8 min

- OH 80° 🡪 8 min

Controles: digestión enzimática (DNAasa), omitir hidrolisis ácida, hervir la placa.

Tejido control: testículo, ovario, amígdala, tumores proliferativos.

2) VERDE METILO PIRONINA

Fundamento.

- Identificación de ácidos nucleicos a partir de los grupos fosfato.

- El verde metilo y la pironina, son colorantes básicos, cuyas afinidades varían según el tejido y el pH.

- El verde metilo (trifenilmetano🡪 mayor peso molecular) colorea el DNA (verde) por afinidad electrostática y la pironina (linear y más pequeña) colorea el RNA (rojo) por interacciones hidrofóbicas 🡪 mecanismo intercalar.

- pH es importante para mantener la estructura del DNA y RNA (solución medianamente ácida)

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