La Clonación De Un Gen A Menudo Requiere De Una Librería De ADN.

La clonación de un gen a menudo requiere de una librería de ADN.

Las librerías de ADN pueden tomar una gran variedad de formas, dependiendo de la fuente de ADN. La librería más común es la librería genómica, que se produce cuando el genoma completo de un organismo es roto en miles de fragmentos y todos ellos se clonan por inserción en un vector de clonación.

En el primer paso, el ADN a ser clonado es parcialmente digerido utilizando una endonucleasa, de tal manera que aparecerán fragmentos de diferentes tamaños. Los tamaños son seleccionados de acuerdo al tamaño del vector de clonación, lo que asegura que las secuencias estén representadas en la librería.

Los fragmentos que son muy grandes o muy pequeños para clonarse, son retirados por centrifugación o electroforesis.

El vector de clonación es cortado con la misma endonucleasa y ligado a los fragmentos de ADN genómico. La mezcla que contiene al ADN genómico ligado al vector, es utilizada para transformar células bacterianas: de tal manera que se generan bacterias o bacteriofagos que contienen diferentes moléculas recombinantes de ADN. Idealmente, todo el ADN genómico puede ser representado en la librería.

Cada bacteria transformada crece en una colonia o clon de células idénticas, debido a que poseen al plásmido recombinante. El reto es identificar al clon que contiene al gen de interés entre cientos de ellos. Para considerar la magnitud de este problema analicemos el siguiente ejemplo:

Considérese el genoma de un mamífero de 3x109 pb. Si se utiliza un cromosoma artificial bacteriano (BAC) como vector de clonación, y si el objetivo es tener el 99% probabilidad de que el gen deseado este representado en la librería, la librería debe contener al rededor de 50,000 BACs recombinantes cada una con diferentes insertos de 300,000 pb.

Se puede utilizar una estrategia alternativa aislando el mARN de un organismo y obtener el ADN complementario (cADN) por la reacción de la reversotranscriptasa.

El ADN de doble cadena resultante, es insertado en un vector y clonado, obteniendo una librería de cADN. Este procedimiento es particularmente importante para aislar genes que se expresan en células especificas, por ejemplo mas de la mitad de los mARNs de las células precursoras de eritrocitos producen globinas, por tanto, son el blanco perfecto para encontrar genes relacionados con estas proteínas.

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